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Traditional ES Cell Targeting: 제작 기간은 12개월이 필요하고 chimera 단계를 거쳐야 합니다.
Traditional ES Cell Targeting은 chimera positive rate가 낮으며 cre deleter와 교배해야 Neo가 제거된 heterozygous mouse를 얻을 수 있어 제작 기간이 10~12개월에 이릅니다. ‘Chimera’ 단계를 건너뛰어 Neo를 스스로 제거함으로써 두 세대의 번식 시간을 줄일 수 있기 때문에 제작 기간이 훨씬 더 빠릅니다.
TurboKnockout® ES Cell Targeting: ‘Chimera’ 단계를 거치지 않고, Neo를 스스로 제거하게 만들어 2세대의 번식 시간을 줄입니다.
ES Cell Targeting 기술을 기반으로 한 TurboKnockout® ES Cell Targeting 기술은 특별한 genetic modification 기술을 사용하여 효율적인 유전적 장점을 가진 TurboKnockout® ES Cell Line를 확립했습니다. 특정 배아 발달 단계에서 micro-injection을 통해 TurboKnockout® ES Cell이 Endogenous ES Cell을 100% 대체하여 ‘chimera’ 단계를 건너뛰게 함으로써 mouse 생산 기간을 6~8개월로 단축시켰습니다. 또한 TurboKnockout®은 독특한 Self-deleting Neo Cassette를 적용하여 생산된 TurboKnockout® mouse를 다른 어떤 품종의 mouse와 교배시켜도 Neo를 100% 자체 제거하는 mouse를 생산할 수 있습니다. 즉, TurboKnockout® 기술은 ‘chimera’ 단계를 건너뛰게 해 줄 수 있음은 물론, Neo를 스스로 제거할 수 있는 Neo를 제거하는 heterozygous mouse를 빠르게 얻을 수 있습니다.
TurboKnockout® ES Cell Targeting 기술 비교：
| 기술 유형 | TurboKnockout® ES Cell Targeting | Traditional ES Cell Targeting |
| 제작 기간 | 6 개월 | 10~12 개월 |
| Potential off-site targeting effects | 없음 | 없음 |
| ‘Chimera’ 단계 생략 | √ | × |
| Neo 자체 제거 | √ | × |
TurboKnockout® 기술의 장점:
Workflow of TurboKnockout® Gene Targeting 마우스
Mouse Strain:
ES Cell Strain: C57BL/6N, BALB/c
Conventional Knock-Out Mouse란 유전자 knockout 기술을 통해 target gene의 모든 exons이나 일부 중요한 exons 또는 기능 구역을 제거함으로써 target gene이 전신의 모든 조직 및 세포에서 발현되지 않는 마우스 모델을 말합니다.
적용:
전신의 생리적 및 병리적 부분에서 유전자의 기능을 연구하는 데 사용됩니다. (해당 유전자가 배아 치사 유전자가 아닌 것을 요구함)
Breeding Scheme
1. 저항성유전자 Neo 제거: 양성 TurboKnockout 마우스는 wildtype 마우스와의 교배를 통하여 targeting vector에서 Neo가 제거된 F1 generation heterozygous KO 마우스(+/-)를 생산합니다.
2. F1 generation heterozygous KO 마우스 한 쌍을 inbreeding시키며 PCR에 의한 screening을 통해 Neo가 제거된 homozygous KO 마우스(-/-)를 얻습니다.
Conditional knockout은 target gene의 한 exon 또는 일부 중요한 exons 양쪽에 LoxP site를 삽입함으로써 2개의 LoxP site를 가진 TurboKnockout-floxed 마우스를 만드는 것입니다. TurboKnockout-floxed 마우스가 cre-expressing 마우스 (cre deleter)와 교배하기 전에 target gene이 완전히 정상적으로 발현됩니다. TurboKnockout-floxed 마우스가 tissue-specific cre-expressing 마우스 (cre deleter) 와 교배를 진행 후, target gene은 특정 조직 또는 세포에서 knockout될 수 있으며 다른 조직이나 세포에서 정상적으로 발현됩니다.
적용:
1. 배아 치사성을 가진 target gene을 연구하는 데 사용됩니다.
2. 특정 조직 또는 세포에서 유전자의 생리적 및 병리적인 기능을 연구하는 데 사용됩니다.
3. Cre 발현을 제어하는 다른 유도 시스템과 결합하면 유전자의 발현에 대하여 시간과 위치를 동시에 조절할 수 있습니다.
Breeding Scheme
1. Cre-expressing 마우스와 교배: TurboKnockout-floxed 마우스가 tissue-specific cre-expressing 마우스와의 교배를 통하여 Neo 저항성이 제거되고 단일 염색체 결손이 생긴 양성 F1 generation tissue-specific heterozygous cKO 마우스(+/-)를 생산합니다.
2. F1 generation 마우스 한 쌍을 inbreeding시키며 PCR에 의한 screening을 통해 target gene이 제거된 F2 generation tissue-specific homozygous cKO 마우스(-/-)를 얻습니다.
유전자 knockin은 target gene 위치에 특정 돌연변이나 외래 유전자를 삽입 할 수 있습니다. 예를 들어, target gene에 포인트 뮤테이션(인간 유전 질환 모델 시뮬레이션)을 도입하거나, homologous recombination을 통해 reporter gene (EGFP, mRFP, mCherry, mYFP 또는 LacZ 등)을 target gene의 특정 부위에 도입함으로써 reporter gene을 통해 target gene의 발현을 추적할 수 있습니다. 또한, KO/KI가 동시에 발생하도록 마우스 자체의 유전자를 reporter gene으로 대체 할 수도 있습니다.
적용:
1. Drug screening 관련 연구에 사용됩니다.
2. Cellular response 모니터링을 하는 데 사용됩니다.
3. 유전자 발현 모니터링을 하는 데 사용됩니다.
Breeding Scheme
1. 저항성유전자 Neo 제거: 양성 TurboKnockout KI 마우스는 wildtype 마우스와의 교배를 통하여 targeting vector에서 Neo가 제거된 F1 generation heterozygous 마우스를 생산합니다.
2. F1 generation heterozygous 마우스 한 쌍을 inbreeding시키며 PCR에 의한 screening을 통해 Neo가 제거된 F2 generation homozygous KI 마우스를 얻습니다.
Humanized Mouse 모델이란 기능성 인간 유전자, 세포 또는 조직을 가진 마우스 모델을 말합니다. 이러한 모델은 일반적으로 인간 질병 체내 연구(in vivo study)를 위한 생체 대체 모델로 사용됩니다. 인간과 동물은 생리적으로 현저한 차이가 있기 때문에 동물 모델을 이용하여 얻은 실험결과를 인체에 적용할 수 없는 경우가 있습니다. 예를 들어, 마우스와 같은 동물 모델을 이용하여 개발된 일부 약물은 인체에 효과가 없습니다. 그러므로 유전자 변형 또는 homologous recombination의 방법을 이용하여 마우스 모델에 인간 유전자를 넣어 제작된 Humanized 마우스 모델은 일부 인간 질병을 시뮬레이션하는 효과를 크게 높였습니다.
적용:
1.에이즈, 암, 전염병, 인간 퇴행성 질환, 혈액 질환 등 연구 분야에 널리 사용됩니다.
2.약물 임상 전의 시뮬레이션 실험에 사용됩니다.
KO-First 기술은 intron에 양쪽에 FRT sites가 가진 유전자 파괴 시스템(splice acceptor, reporter gene 및 Neo 포함)을 삽입함으로써 knockout의 목적을 달성합니다. 그 외에 knonckout하는 target gene의 exons 양쪽에 각각 하나의 LoxP site를 삽입합니다. 이렇게 얻은 마우스는 target gene이 knonckout되는 동시에 reporter gene과 Neo가 knockin된 마우스였습니다. 실험의 필요에 따라, Cre-LoxP 재조합 시스템 또는 Flp-FRT 재조합 시스템의 활용을 통해 conventional knock-out 마우스 및 conditional knock-out 마우스 모델을 동시에 얻을 수 있습니다. 즉, 이 마우스가 cre-expressing 마우스와 교배될 때, target gene이 knonckout되는 동시에 reporter gene이 knockin된 마우스를 얻을 수 있습니다. 또한 이 마우스가 Flp 마우스와 교배될 때, 이미 제거된 유전자의 발현을 복구할 수 있어 conditional knock-out 마우스를 얻을 수 있으며, 이를 바탕으로 cre-expressing 마우스와 또 교배하면 knock-out 마우스를 얻을 수 있습니다.