녹아웃(KO) 마우스 | Cyagen Korea

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“Among several commercial services who have claimed to be specialized to generate mouse models with genetic modifications, I recognize that Cyagen is one of the best. We are looking forward to having more cooperation with them.”

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ES Cell Targeting Knock-Out / Knock-In 마우스

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Knock-Out 및 Knock-In Mouse의 제작을 위한 전통적인 Gene Targeting 기술은 DNA 상동재조합(Homologous Recombination) 및 배아줄기세포 등에 기초를 둔 분자생물학 기술입니다.

 

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ACE2 마우스 모델: C57BL/6J 및 BALB/c strain, Starting From $3,599

 

제작 원리

Knock-Out 및 Knock-In Mouse의 제작을 위한 전통적인 Gene Targeting 기술은 DNA 상동재조합(Homologous Recombination) 및 배아줄기세포 등에 기초를 둔 분자생물학 기술입니다.

상동재조합은 외래 DNA 단편이 숙주 게놈 단편과 상동성이 높을때, homologous DNA 부분이 숙주 DNA의 해당 단편과 교환될 수 있다는 것을 의미합니다. 

Gene Targeting은 외래 유전자를 targeting 세포의 게놈상의 특정 부위에 상동재조합 기술을 통해 통합함으로써 염색체에 있는 어떤 유전자를 수정하기 위한 것입니다. 현재 Gene Targeting 기술은 살아있는 유기체가 가지고 있는 유전자 물질의 특정 변형 및 변형을 위한 이상적인 방법으로 널리 알려져 있습니다. 특히 조건부 및 유도성 Gene Targeting System의 확립은 시간과 공간에서 Gene Targeting Modification을 더욱 정확하고 신뢰성 있게 할 수 있도록 해 주었고, 이 기술의 개발은 발생생물학, 분자유전학, 면역학, 의학 및 기타 분야에 새롭고 강력한 치료 수단을 제공해 줄 뿐만 아니라, 유도전망한 미래와 높은 상업적 가치 또한 보여주었습니다.

 

Workflow of Gene Targeting 마우스 Service

 

Mouse Strains:

ES Cell Strains: C57BL/6N(black), C57BL/6N(agouti), BALB/c

 

Gene Targeting에 자주 사용하는 마우스 Model:

Conventional Knock-Out Mouse란 유전자 knockout 기술을 통해 target gene의 모든 exons이나 일부 중요한 exons 또는 기능 구역을 제거함으로써 target gene이 전신의 모든 조직 및 세포에서 발현되지 않는 마우스 모델을 말합니다.

 

적용:

전신의 생리적 및 병리적 부분에서 유전자의 기능을 연구하는 데 사용됩니다. (해당 유전자가 배아 치사 유전자가 아닌 것을 요구함)

 

Breeding Scheme

1. Chimera 마우스 확인: 마우스의 털색에 의해 chimera 마우스(흑백이 서로 섞임)를 판단합니다. 흑색의 비율이 클수록 chimeric rate가 높아집니다.

2. 저항성유전자 Neo제거: Chimeric rate가 높은 chimera 마우스를 선별하여 Flp deleter 마우스와 교배를 시키며 PCR에 의한 screening을 통해 targeting vector에서 Neo가 제거된 F1 heterozygote를 얻습니다.

3. F1 마우스 한 쌍을 선별하여 inbreeding시키며 PCR에 의한 screening을 통해 Neo가 제거된 F2 generation homozygous KO 마우스(gene-/-)를 얻습니다.

**PCR primer design 원칙: Neo 전후 위치에서 PCR primer design을 통해 Neo 제거 여부를 확인합니다.

 

Conditional knockout은 target gene의 한개 또는 여러개의 중요한 exons 양쪽에 LoxP site를 삽입함으로써 floxed 마우스를 만드는 것입니다. 이 floxed 마우스가 cre-expressing 마우스 (cre deleter)와 교배하기 전에 target gene 완전히 정상적으로 발현되고 tissue-specific cre-expressing 마우스 (cre deleter) 와 교배를 진행 후 target gene은 특정 조직 또는 세포에서 knockout될 수 있으며 다른 조직이나 세포에서 정상적으로 발현됩니다.

 

적용:

1. 배아 치사성을 가진 target gene을 연구하는 데 사용됩니다.

2. 특정 조직 또는 세포에서 유전자의 생리적 및 병리적인 기능을 연구하는 데 사용됩니다.

3. Cre 발현을 제어하는 다른 유도 시스템과 결합하면 유전자의 발현에 대하여 시간과 위치를 동시에 조절할 수 있습니다.

   

Breeding Scheme

1. Chimera 마우스 확인: 마우스의 털색에 의해 chimera 마우스(흑백이 서로 섞임)를 판단합니다. 흑색의 비율이 클수록 chimeric rate가 높아집니다.

2. 저항성유전자 Neo 제거:Chimera 마우스를 Flp deleter 마우스와 교배를 시키며 PCR에 의한 screening을 통해 targeting vector에 Neo가 제거된 F1 heterozygote를 얻습니다.

3. F1 마우스 한 쌍을 선별하여 inbreeding시키며 PCR에 의한 screening을 통해 두개의 Frt sites가 제거된 F2 generation homozygous 마우스(geneflox/flox 마우스)를 얻습니다.

*geneflox/flox 마우스의 두 염색체에 다 loxp–gene-loxp 를 가지고 있는 모델입니다.

**PCR primer design 원칙: Frt sites 전후 및 3’arm 서열에 따라 primer를 design하여 Neo 제거 여부를 확인하며 LoxP sites 전후 서열에 따라 primer를 design하여 LoxP를 확인합니다.

4. Tissue-specific knockout 모델: Geneflox/flox 마우스가 tissue-specific cre-expressing 마우스와 교배하며 PCR에 의한 screening을 통해 유전자가 제거된 F3 generation heterozygous 마우스를 얻습니다.

5. F3 마우스 한 쌍을 선별하여 inbreeding시키며 PCR에 의한 screening을 통해 유전자가 제거된 F4 generation homozygous cKO 마우스를 얻습니다.

**PCR primer design 원칙: cKO region 전 5’arm 및 3’arm 유전자 서열에 따라 primer를 design하여 제거 여부를 확인합니다.

  

유전자 knockin은 target gene 위치에 특정 돌연변이나 외래 유전자를 삽입 할 수 있습니다. 예를 들어, target gene에 포인트 뮤테이션(인간 유전 질환 모델 시뮬레이션)을 도입하거나, homologous recombination을 통해 reporter gene (EGFP, mRFP, mCherry, mYFP 또는 LacZ 등)을 target gene의 특정 부위에 도입함으로써 reporter gene을 통해 target gene의 발현을 추적할 수 있습니다. 또한, KO/KI가 동시에 발생하도록 마우스 자체의 유전자를 reporter gene으로 대체할 수도 있습니다.

 

적용:

1. Drug screening 관련 연구에 사용됩니다.

2. Cellular response 모니터링을 하는 데 사용됩니다.

3. 유전자 발현 모니터링을 하는 데 사용됩니다.

 

Breeding Scheme

1. Chimera 마우스 확인: 마우스의 털색에 의해 chimera 마우스(흑백이 서로 섞임)를 판단합니다. 흑색의 비율이 클수록 chimeric rate가 높아집니다.

2. 저항성유전자 Neo 제거: Chimera 마우스를 Flp deleter 마우스와 교배를 시키며 PCR에 의한 screening을 통해 targeting vector에 Neo가 제거된 F1 heterozygote를 얻습니다.

3. F1 마우스 한 쌍을 선별하여 inbreeding 시키며PCR에 의한 screening을 통해 Neo가 제거된 F2 generation homozygous KI 마우스를 얻습니다.

**PCR primer design 원칙: Neo 전후 위치에서 PCR primer design을 통해 Neo 제거 여부를 확인합니다.

 

Humanized Mouse 모델이란 기능성 인간 유전자, 세포 또는 조직을 가진 마우스 모델을 말합니다. 이러한 모델은 일반적으로 인간 질병 체내 연구(in vivo study)를 위한 생체 대체 모델로 사용됩니다. 인간과 동물은 생리적으로 현저한 차이가 있기 때문에 동물 모델을 이용하여 얻은 실험결과를 인체에 적용할 수 없는 경우가 있습니다. 예를 들어, 마우스와 같은 동물 모델을 이용하여 개발된 일부 약물은 인체에 효과가 없습니다. 그러므로 유전자 변형 또는 homologous recombination의 방법을 이용하여 마우스 모델에 인간 유전자를 넣어 제작된 Humanized 마우스 모델은 일부 인간 질병을 시뮬레이션하는 효과를 크게 높였습니다.

 

적용:

1. 에이즈, 암, 전염병, 인간 퇴행성 질환, 혈액 질환 등 연구 분야에 널리 사용됩니다.

2. 약물 임상 전의 시뮬레이션 실험에 사용됩니다.

 

KO-First 기술은 intron에 양쪽에 FRT sites가 가진 유전자 파괴 시스템(splice acceptor, reporter gene 및 Neo 포함)을 삽입함으로써 knockout의 목적을 달성합니다. 그 외에 knonckout하는 target gene의 exons 양쪽에 각각 하나의 LoxP site를 삽입합니다. 이렇게 얻은 마우스는 target gene이 knonckout되는 동시에 reporter gene과 Neo가 knockin된 마우스였습니다. 실험의 필요에 따라, Cre-LoxP 재조합 시스템 또는 Flp-FRT 재조합 시스템의 활용을 통해 conventional knock-out 마우스 및 conditional knock-out 마우스 모델을 동시에 얻을 수 있습니다. 즉, 이 마우스가 cre-expressing 마우스와 교배될 때, target gene이 knonckout되는 동시에 reporter gene이 knockin된 마우스를 얻을 수 있습니다. 또한 이 마우스가 Flp 마우스와 교배될 때, 이미 제거된 유전자의 발현을 복구할 수 있어 conditional knock-out 마우스를 얻을 수 있으며, 이를 바탕으로 cre-expressing 마우스와 또 교배하면 knock-out 마우스를 얻을 수 있습니다.

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