Cyagen의 전문가가 프로젝트 요구 사항에 대한
견적,
정보 및 예상 소요시간을 제공해 드릴 것
입니다.
"Among several commercial services who have claimed to be specialized to generate mouse models with genetic modifications, I recognize that Cyagen is one of the best. We are looking forward to having more cooperation with them."
Korea Brain Research Institute (KBRI)영업일 기준 1-2일 내에 답변해 드리겠습니다.
CAR(키메라 항원 수용체)는신호 펩티드, 항체에서 유래된 단일 사슬 가변 영역, 힌지 영역, 막관통 도메인, 공동 자극 분자 구조 및 CD3ζ 신호 전달 도메인으로 구성된다. CAR 분자 설계 및 렌티바이러스 제조 과정은 세포 치료 개발에서 중요한 단계이며 몇 가지 주요 단계를 포함한다.
scFv 스크리닝：
scFv의 친화성과 특이성은 CAR 분자의 기능에 상당한 영향을 미치며 기능적 항원 결합 활성을 가진 적절한단일 사슬 가변 단편을(scFvs)선별하는 것이 필수적이다.
링커의 최적화：
서로 다른 길이의 링커를 설계하여 VH와 VL 사이의 유연성을 증가시켜 결합 친화력에 영향을 미친다.
힌지 영역의 최적화：
항원 결합 도메인의 공간적 유연성을 높이기 위해 다양한 길이의 경첩을 디자인한다.
공동 자극 분자 구조의 선택：
다른 공동 자극 분자는 다른 특성을 가지고 있으며 4-1BB와 CD28은 가장 많이 사용되는 공동 자극 분자이다.
보고 유전자:
녹색 형광 단백질 유전자 또는 다른 태그 유전자를 연결하여 CAR 분자의 성공적인 형질도입을 특성화할 수 있습니다.
그림 1. CAR 분자 구조.
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카테고리
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공급원 | 기능 | 발현 부위 |
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신호펩티드
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CD8α, GM-CSF 등 |
CAR 분자를 세포막으로 유도 |
세포외 |
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항체 scFv |
특허, 문헌, 항체 개발
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종양 항원의 표적 인식 |
세포외 |
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힌지 영역 |
CD8α, IgG1, IgG4, IgGD 등 |
scFv와 세포막 사이의 상대적인 공간 형태 유지
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세포외 |
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막관통 도메인 |
CD8α, CD28, CD4 등 |
앵커 CAR 분자 막 발현 |
막관통 |
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공동 자극 분자 |
4-1BB, CD28, CD27, ICOS 등 |
T 세포 활성화 2차 신호 제공 |
세포내 |
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신호 분자 |
CD3ζ |
T 세포에 대한 첫 번째 활성화 신호 제공 |
세포내 |
표1. CAR 분자 설계에 사용되는 공통 요소.
CAR 분자를 설계한 후 다이어그램에 표시된 대로 일반적으로 합성되고 렌티바이러스 셔틀 플라스미드에 서브클로닝되어 CAR 발현 벡터를 생성한다. 또한 Cyagen은 지속적으로 업데이트되고 확장되는 인간 CD19, BCMA, GPC3, FAP, HER2 및 기타 항원을 대상으로 하는 다양한 재고 CAR 렌티바이러스 플라스미드를 제공한다.
그림 2. CAR 렌티바이러스 벡터 구조.
Cyagen은 렌티바이러스 벡터 제조에 대한 경험이 풍부하며 다양한 렌티바이러스 제조 서비스를제공한다. Cyagen은 매우 안전한 3세대 렌티바이러스 패키징 시스템을 사용하여 그림 4에 설명된 제조 프로세스를 따른다.
그림 3. 렌티바이러스 패키징 기술 로드맵.
결과물:
고객 제공 자료:
CD19 항원을 발현하는 정제된 렌티바이러스를 구배 희석(0.01, 0.1, 1 및 10μL의 4가지 구배)하고 동일한 수의 293T 세포에 첨가하였다. 72시간 후 렌티바이러스 감염에 대해 양성인 293T 세포의 백분율(즉, 총 세포 수 중 렌티바이러스에 감염된 293T 세포의 백분율)을 유동 세포측정법으로 결정하여 렌티바이러스 형질도입 역가를 계산하였다.
그림 4. CD19 항원에 대한 렌티바이러스 적정 결과.
그림에서 보는 바와 같이 CD19 항원 양성 세포의 수는 바이러스 형질도입 구배가 증가함에 따라 점차 증가하여 렌티바이러스의 감염력이 양호함을 알 수 있다. 바이러스 역가는 1.4 × 108 TU/mL로 계산되었다.
앞서 언급한 CD19 항원 렌티바이러스를 사용하여 293T 세포를 형질감염시켜 여러 차례의 스크리닝을 거쳐 CD19 항원의 발현이 높은 매우 균일한 CD19-293T 안정적인 세포주를 얻었다.
그림 5. CD19-293T 세포에서 CD19 항원 양성율 검출 결과.
우리는 다음과 같은 구조로 CD19 항원을 표적으로 하는 FMC63 CAR 분자를 설계하고 렌티바이러스 제조를 위해 렌티바이러스 벡터에 구축하였다. FMC63 CAR의 렌티바이러스 역가는 앞서 언급한 방법을 사용하여 검출되었으며 약 4.33 × 108TU/mL인 것으로 확인되었다.
그림 6. FMC63 CAR 분자 구조.
그림 7. FMC63 CAR 렌티바이러스 적정 결과.