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유도만능줄기세포(iPSC)

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유도만능줄기세포(iPSC)는 특정 세포 유형, 조직 및 기관으로 재분화할 수 있기 때문에 유전자 편집 기술과 결합하면 질병 발병 메커니즘을 탐구하여 새롭고 효과적인 약물 및 세포 치료법을 개발하는 데 사용할 수 있습니다. Cyagen은 첨단 세포 재프로그래밍, 유전 공학 및 세포 분화 기술을 통해 iPSC를 위한 원스톱 체외 서비스 플랫폼을 제공합니다. Cyagen원스톱 표현형 분석 플랫폼을 통합하여 다양한 질병 응용 분야에 걸쳐 iPSC를 위한  in vitro 모델 개발 및 테스 서비스를 제공할 수 있습니다.

 

 

연구 응용을 위한 iPSC 모델의 장점

·기초 연구: 발생생물학 연구를 위한 강력한 도구로, 배아줄기세포(Embryonic stem cells, ESCs)와 관련된 윤리적 논란을 피하고 이론적으로 in vitro에서 무한한 확장과 분화가 가능하여 대규모 약물 스크리닝과 구하기 어려운 단일세포계(Primary cell line)의 대체에 유용합니다.

·약물 개발: iPSCs는 이론적으로 인체의 모든 세포 유형으로 분화할 수 있고, 인간 질환의 발생을 더 잘 시뮬레이트할 수 있으며, 약물 안전성 및 효능 연구에 적합합니다.

·혁신적인 치료법: iPSCs는 환자 자신의 세포에서 유도되어 잠재적인 면역 거부 문제를 해결하고, 단일 유전적 배경을 가진 세포주를 생성하여 다른 유전적 배경의 차이로 인한 표현형 변이를 줄일 수 있습니다.

·자가 치료: iPSCs분화 잠재력을 바탕으로 손상되거나 퇴화한 장기 및 조직의 복구에 적용하기 위해 많은 임상 시험이 완료되었거나 진행 중입니다.


iPSC 기술 서비스 및 제공 기준

유형

프로젝트

표준 납품물

품질관리(QCs)

소요기간


Reprogramming


iPSC Reprogramming Technology Service


One iPSC clone, each clone provides two vials of cryopreserved cells (1x10^6 cells/vial), with an experimental report


Flow cytometry for SSEA4/TRA-1-81, immunofluorescence for OCT4/NANOG, karyotype analysis, microbial testing, STR, in vitro trilineage differentiation (optional), teratoma formation (optional), exogenous residue testing


Starting from 12 weeks

Gene Edited Cell Lines (iPSCs)

Knockout (KO)

1 monoclonal heterozygous cell line, 2 tubes (10^6/tube), experiment report

PCR and sequencing, immunofluorescence

Starting from 8 weeks

Point mutation (PM)

Starting from 12 weeks

Knock-in (KI)

Starting from 12 weeks

Transfected Stable Cell Lines (iPSC)

Transfection stable Knockdown expression

Transfected stable cell lines, 2 tubes/strain (10^6/tube), including control cell lines, experiment report

qPCR, immunofluorescence

Cell pool: 9-11 weeks; Monoclonal: 13-15 weeks

Stable overexpression strain

Cell pool: 8-10 weeks + gene synthesis; Monoclonal: 12-14 weeks + gene synthesis


Directed Differentiation


Motor Neuron Differentiation


Motor neuron precursor cells and mature motor neuron differentiation kit for 10^7 cells


Immunofluorescence (MNP Oligo2/MNs CHAT)


Starting from 6 weeks


CD34+ Differentiation


Two vials of cryopreserved cells (1x10^6 cells/vial)


qPCR, flow cytometry, immunofluorescence


Starting from 3 weeks


NPC (Neural Progenitor Cell) Differentiation


Two vials of cryopreserved cells (1x10^6 cells/vial)


Immunofluorescence (SOX2/PAX6/Nestin)


Starting from 2 weeks


RPE (Retinal Pigment Epithelium) Differentiation


RPE precursor cells and mature RPE differentiation kit for 10^7 cells


Immunofluorescence (Transcription factor MiTF/mature RPE ZO-1)


Starting from 5 weeks


Liver Organoid Differentiation


One vial of cryopreserved liver organoids (1 set - 10 units)


qPCR, flow cytometry, immunofluorescence


Starting from 8 weeks

 

Cyagen iPSC 기술 서비스의 특징

    기술적 도전

Cyagen의 솔루션

Reprogramming: 초기 방법은 레트로바이러스(retroviruses)와 렌티바이러스 벡터 등에 의존했지만, 바이러스 게놈 통합으로 인해 전이유전자 재활성화될 위험이 있었습니다.

에피솜 벡터(추가 플라스미드)를 이용한Reprogramming은 non-integrated 인간 iPS 세포를 생산하면서 다능성 줄기세포 유전자를 전사하고 발현하는 데 사용됩니다. 이 방법은 게놈이 통합된 바이러스 벡터를 사용하는 것보다 안전성이 더 높습니다.

Cyagen은 거의 iPSC Reprogramming 모든 측면을 개선했습니다:

업그레이드된 Delivery vector는 최대 50%의 HDR 효율, 50% 이상의 transfection 효율, 그리고 80% 이상의 transfection viability를 제공하고, RNP 전달이 최대 90%의 KO 효율을 달성하습니다.

세포 배양: Harsh culture 조건은 유전자 편집 과정에서 세포가 능성을 잃고 분화할 수 있습니다.

Cyagen은 18년의 줄기세포 배양 경험을 바탕으로 컴팩트한 내부, 균일한 크기  특징을 가진 이상적인 iPSC colony를 배양할 수 있는 첨단 iPSC 편집 및 배양 시스템을 개발했습니다.

iPSC 유전자 편집: 서로 다른 개인 또는 조직에서 얻은 iPSC 간의 유전적 차이가 크고 정밀한 유전자 수정을 수행하기가 매우 어렵습니다.

 

 Cyagen의 유전자 편집 플랫폼은 iPSC 연구 프로젝트의 성공을 위해 개발되어 다음과 같은 장점을 제공합니다:

  •  지능형 Smart-CRISPR™ 세포 유전자 편집 시스템: 고효율적, low-off-target gRNA를 과학적으로 설계할 수 있습니다.
  •  독점적인 α-donor 벡터 HDR 시스템:  편집기술보다 훨씬 높은 최대 50%의 HDR 효율로 footprint-free repairs가 가능합니다.
  •  적절한 transfection 조건: transfection 조건을 최적화하여  50% 이상의 transfection 효율, 최대 80%의 viability를 달성 할 수 있습니다.
  •  RNP 전달 시스템: RNP 전달을 선택하여 gRNA 분할 효율과 transfection cell viability를 향상시키고 off-target 비율을 줄이며, 최대 90%의 KO 효율을 제공합니다.

단일 클론 형성: 안정적인 단일 클론 iPSC 배양과 낮은 cloning 비율을 위한 복잡한 준비과정이 있습니다.

Cyagen유일 단일 세포 스크리닝 기술을 사용하면 단일 클론의 형성률이 30% 이상에 달할 수 있으며, 한 번의 스크리닝으로 충분한 양의 positive clones를 얻을 수 있습니다.

직접 분화: 다양한 출처의 iPSC 세포주 간에는 분화 능력과 증식 속도에 차이가 있습니다.

 

목표 분화 세포 유형에 더 적합한 iPSCs를 우선으로 선택하고 배지와 첨가제를 최적화함으로써 분화의 특이성과 효율성을 크게 향상시켜 미성숙 또는 미분화 세포의 비율을 효과적으로 줄일 수 있습니다.



iPSC Reprogramming

Cyagen은 혈액에서 채취한 체세포 샘플을 reprogramming하여 non-integrating 인간 iPSC를 생성할 수 있는 첨단 체세포 reprogramming 기술을 보유하고 있습니다.

 

iPSC Reprogramming 서비스 프로세스

 

                                                                                       

iPSC Reprogramming 서비스

  유형

프로젝트

방법

내용

Establishment of iPSC Lines from Somatic Cells

Reprogramming

Episomal Plasmid

Establishment of iPSC Lines from Peripheral Blood


iPSC Characterization


iPSC Marker Detection


Immunofluorescence


Ratio of Positive Markers OCT-4/NANOG

Flow Cytometry


Ratio of Positive Markers SSEA-4/TRA-1-60


Self-Renewal Capacity


AP Staining


iPSC Pluripotency Test


Genomic Stability


Chromosome Analysis


Karyotyping

Cell Source Identification

STR Profiling Test

Verification of Homology with the Starting Cells


Differentiation Potential

Tri-lineage Differentiation

In Vitro Differentiation Capacity Verification

Teratoma Formation Assay of iPSC In Vivo Differentiation Capacity

In Vivo Differentiation Capacity Verification


No Exogenous Gene Integration

PCR


Vector Sequence PCR Detection

 

 

iPSC 검출 및 기능 식별 

 

- Cell Morphology

 

 

 

- Karyotyping

 

 

 

- STR Profiling

 

 

- Cell-Specific Markers

 

- Flow Cytometry Analysis

 

 

- In Vitro Tri-lineage Differentiation

- Teratoma Formation Assay

 

 

 

iPSC Reprogramming 서비스 장점

- Somatic cells extracted from blood are used to produce high-quality iPSCs with a success rate of up to 99%.

- Utilization of stable episomal vectors in non-integrative reprogramming ensures non-integrated human IPS cells while preserving downstream experiments.

- Standardized operational procedures compatible with various culture systems enable large-scale production of high-purity cells.

- We provide complete customization options to meet researchers' specific needs.

- 혈액에서 추출한 체세포를 사용하여 최대 99%의 성공률로 고품질의 iPSC를 생성합니다.

- Non-integrative reprogramming에서 안정적인 에피솜 벡터를 활용하여 non-integrated human IPS 세포를 보장하는 동시에 downstream 실험을 보존할 수 있습니다.

- 다양한 배양 시스템과 접합하고 표준화된 조작 절차로 고순도 세포의 대량 생성이 가능합니다.

- Cyagen은 연구자의 특정 요구 사항을 충족하기 위해 완벽한 맞춤형 옵션을 제공합니다.

 

iPSC 유전자 편집

유전자 편집 기술과 결합하면 iPSCs는 질병의 메커니즘을 탐구하고 효과적인 신약 및 세포 치료법을 개발하는 데 사용될 수 있습니다. Cyagen의 iPSC 질환 모델 연구 플랫폼은 성숙한 유전자 편집 기술과 줄기세포 배양 시스템을 갖추고 있으며, 현대의 중개 및 재생 의 연구에 필요한 iPSC 배양, 유전자 변형 및 단일 클론화와 관련된 많은 어려움을 극복해 왔습니다. Cyagen의 특허 프로세스는 맞춤형 iPSC 모델의 거의 모든 측면을 개선했으며, 업그레이드된 delivery vector는 최대 50%의 HDR 효율, 50% 이상의 transfection 효율, 80% 이상의 transfection viability, 그리고 최대 90%의 KO 효율 RNP delivery 등을 실현할 수 있습니다.

 

Cyagen의 프로세스는 강력한 AI 알고리즘을 활용하여 강화되었습니다. 예를 들면, 희귀질환 데이터 센터(RDDC)의 지원을 받아 개발된 RNA splicing 모델 도구가 WB-negative 클론 선별하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 또한 Smart-CRISPR™ 세포 유전자 편집 시스템은 유전자 knockout 및 기타 유전자 편집 전략을 신속하게 설계할 수 있어 편집 효율이 90%에 달합니다.

 

iPSC 유전자 편집 기술 프로세스


iPSC 유전자 편집 서비스

 유형

 프로젝트

 표준 납품물

 품질관리(QCs)

 소요기간

Gene Edited Cell Lines (iPSCs)

Knockout (KO)

1 monoclonal heterozygous cell line, 2 tubes (10^6/tube), experiment report

PCR and sequencing, immunofluorescence

From 8 weeks

Point mutation (PM)

From 12 weeks

Knock-in (KI)

From 12 weeks

Transfected Stable Cell Lines (iPSCs)

Transfection stable Knockdown expression

Transfected stable cell lines, 2 tubes/strain (10^6/tube), including control cell lines, experiment report

qPCR, immunofluorescence

Cell pool: 9-11 weeks; Monoclonal: 13-15 weeks

Stable overexpression strain

Cell pool: 8-10 weeks + gene synthesis; Monoclonal: 12-14 weeks + gene synthesis

 

 

iPSC 유전자 편집 서비스 사례 연구: EGFP Knock-in AAVS1 세포주 모델

유전자 편집 기술을 사용하여 유도만능줄기세포(iPSC)의 AAVS1 유전자좌에 EGFP 유전자를 knock-in 하였습니다. 그림과 같이 sgRNA와donor를 RNP 방법을 통해 iPSC에 transfect 한 후 HDR pathway를 통해 EGFP 서열을 AAVS1 유전자좌에 삽입했습니다.

 

그림 1. EGFP Knock-in 전략 설계

 

PCR 및 염기서열 식별을 통해AAVS1 유전자좌에 EGFP가 knock-in 된 homozygous iPSC 세포주를 얻었고, 형광 현미경으로 100% EGFP 발현이 관찰될 수 있습니다. 세포 배양 후 G-banding을 사용하여 수행한 염색체 핵형 분석 결과는 46개의 정상 염색체 수를 보였으며 뚜렷한 구조적 이상은 없었습니다. 세 가지의 다능성  markers  NANOG, OCT4, SOX2에 대한 면역 형광 염색 결과는 positive signal 검출되어 knocked-in 세포의 다분화능(stemness)을 나타냈습니다.

 

그림 2. iPSC-EGFP Knock-inGel Electrophoresis 식별 결과

 

참고: 프라이머(primer) 설계 전략은 전체 EGFP와 게놈 위치의  upstream downstream서 부분 염기서열을 증폭하는 것을 목표로 했습니다. EGFP를 삽입하지 않은 band는 762bp에 있었고, EGFP를 성공적으로 삽입한 band는 3194bp에서 관찰되었습니다. 그 결과 4개의 monoclonal lines에서 band가 3194bp에 나타나 EGFP와 homozygous clones 성공적으로 삽입되었음을 나타냅니다.

 

 

 

그림 3. iPSC-EGFP Knock-in 시퀀싱 결과

 

그림 4.  iPSC-EGFP Knock-in Homozygous Clone 형광 이미지

(iPSC Homozygous Clones에서 100% 발현된 EGFP)

 

그림 5. iPSC-EGFP Knock-in의 핵형 분석

(세포 배양 후 G-banding을 이용한 염색체 핵형 분석 결과, 뚜렷한 구조적 이상 없이 46개의 정상 염색체 수를 보입니다)

 

그림 6: iPSC-EGFP 면역 형광 - 다분화능 검출: 다능성 markers NANOG, OCT4 및 SOX2에 대한 면역 형광 염색은 positive signal 감지하여 knocked-in 세포의 다분화능나타냅니다.

 

Cyagen iPSC 유전자 편집 서비스의 장점

  • 첨단 유전자 편집 기술 플랫폼: in vivo 동물 실험부터 in vitro 세포 실험에 이르기까지 Cyagen 수만 건 이상의 성공적인 유전자 편집 프로젝트를 통해 세포 유전자 발현 조절, 세포 기능 검증, 마우스 질환 모델의 개발 및 표현형 분석을 포함한 포괄적인 서비스를 제공합니다.
  • 최적화 및 업그레이드된 iPSC 유전자 편집 시스템: 새롭게 업그레이드된 Cyagen의 delivery vectors는 최대 50%의 HDR 효율, 50% 이상의 transfection 효율, 그리고 80% 이상의 transfection viability를 달성합니다.
  • AI 알고리즘강력한 지원: 희귀질환 데이터 센터(RDDC)를 바탕으로 Cyagen의 RNA splicing 모델 도구는 WB-negative clones를 선별하는 데 도움을 줍니다. Cyagen의  Smart-CRISPR™ 세포 유전자 편집 시스템을 사용하면 유전자 knockout 및 유전자 knock-in과 같은 다양한 전략을 쉽게 구현할 수 있으며, 유전자 편집 효율은 최대 90%에 이를 수 있습니다.
  • 전문적인 프로젝트 관리: Cyagen은 24시간 이내에 계획서를 제공하고, 프로젝트 진행 상황을 정기적으로 업데이트하며, 기술 지원과 상세한 납품 보고서를 제공하는 박사 연구팀을 보유하고 있습니다. 또한 Cyagen은 연구 프로젝트 요구사항에 따라 다양한 클론(homozygous, heterozygous, and controls)을 제공합니다.

 

iPSC 직접 분화

직접 분화란 특정 실험 조건과 세포 배양 시스템을 통해 신경세포, 심근세포, 간세포 등과 같은 특정 유형의 체세포로 전환하도록 iPSC를 유도하는 것을 말합니다. Cyagen은 다양한 질환 모델 개발 및 약물 스크리닝 기능을 제공하여 연구자들에게 고품질의 iPSC 모델 서비스를 제공할 수 있습니다.

 

iPSC 직접 분화 서비스

 

프로젝트

표준 납품물

품질관리(QCs)

소요기간


Motor Neuron Differentiation

Motor neuron precursor cells and mature motor neuron differentiation kit for 10^7 cells

Immunofluorescence (MNP Oligo2/MNs CHAT)

From 6 weeks

CD34+ Differentiation

Two vials of cryopreserved cells (1x10^6 cells/vial)

qPCR, flow cytometry, immunofluorescence

From 3 weeks


NPC (Neural Progenitor Cell) Differentiation

Two vials of cryopreserved cells (1x10^6 cells/vial)

Immunofluorescence (SOX2/PAX6/Nestin)

From 2 weeks


RPE (Retinal Pigment Epithelium) Differentiation


RPE precursor cells and mature RPE differentiation kit for 10^7 cells


Immunofluorescence (Transcription factor MiTF/mature RPE ZO-1)


From 5 weeks

Liver Organoid Differentiation

One vial of cryopreserved liver organoids (1 set - 10 units)

qPCR, flow cytometry, immunofluorescence

From 8 weeks



iPSC 직접 분화 서비스 사례 연구: iPSC 모델 분화 능력

  • 신경 전구세포(Neural progenitor cell, NPC) 분화 - 신경 질환 및 약물 모델

 

  • 운동 뉴런(Motor neuron, MN) 분화 - 루게릭병(Amyotrophic lateral sclerosis, ALS)과 같은 신경 질환 및 약물 모델

 

  • 조혈모세포(Hematopoietic stem cell, HSC) CD34+ 세포 분화 - NK 세포, T 세포 등과 같은 조혈 lineage 세포로의 분화에 사용할 수 있습니다. 

 

 

 

위에 제품이나 서비스에 관심이 있으시면 저희한테 연락 부탁드립니다.