Cyagen의 전문가가 프로젝트 요구 사항에 대한
견적,
정보 및 예상 소요시간을 제공해 드릴 것
입니다.
"Among several commercial services who have claimed to be specialized to generate mouse models with genetic modifications, I recognize that Cyagen is one of the best. We are looking forward to having more cooperation with them."
Korea Brain Research Institute (KBRI)영업일 기준 1-2일 내에 답변해 드리겠습니다.
제작 원리
Transgenic Mouse를 만드는 데 가장 흔히 사용되는 한 가지 방법은 DNA pronuclear micro-injection(DNA 원핵 미세주입)입니다. DNA pronuclear micro-injection이란 exogenous DNA(외래 DNA)를 미세주입을 통해서 수정란의 원핵에 주입하고, 주입된 DNA가 마우스 수정란의 게놈에 통합되어 자손에게 안정적으로 유전되는 것을 말합니다. Cyagen이 PiggyBac 시스템 DNA micro-injection을 사용하여 제작한 Transgenic Mouse의 양성 유전자 발현율은 conventional plasmid DNA micro-injection으로 제작한 Transgenic Mouse의 2배 이상입니다!
PiggyBac 시스템으로 효율적인 Transgenic 서비스 제공!
PiggyBac 기술 원리:
PiggyBac(PB) 시스템은 PB Transposon 특유의 ‘잘라 내기 및 붙여 넣기(cut and paste)’ 메커니즘을 이용하여 DNA 단편이 vector와 genome 사이에서 자유롭게 이동하도록 함으로써 외래 DNA 단편이 genome으로 통합되는 것을 효과적으로 중재합니다. 전위 시, PB 트랜스포아제(PB transposase)는 transposon vector의 양 끝에 위치한 특정 transposon 역 말단 반복 시퀀스(inverted terminal repeat sequences, ITRs)를 인식하며, transposon의 말단에 결합하여 짧은 헤어핀 구조를 형성하고 ‘잘라 내기’를 한 후에 genome의 TTAA 부위에 ‘붙여 넣기’를 합니다. Cyagen 실험 데이터에 따르면 PiggyBac 시스템의 양성 유전자 발현율은 conventional plasmid DNA micro-injection보다 2배 이상 높습니다!
PiggyBac(PB)시스템의 5대 장점:
Mouse Strains:
C57BL/6 Mouse: 이러한 일반적인 근교계는 흔히 ‘B6’, ‘C57 블랙 6’ 또는 ‘C57’ 이라고 하며 종양, 면역, 유전학 등의 연구에 널리 사용되어 왔으며, 논문 발표를 위해 우선적으로 선택되고 있는 mouse strain이 되었습니다.
FVB Mouse: 원핵은 크고 선명하며, 근교계이며 유전자형이 비교적으로 단일합니다. 또한 원핵 주입하기에 쉽다는 장점이 있습니다.
Transgenic 마우스 종류:
프로모터와 타겟 유전자를 포함한 벡터를 제작한 후에 마우스 수정란에 microinjection합니다. 벡터 제작 시 상이한 Conventional/Tissue-specific/Inducible 프로모터를 사용하여 유전자가 마우스 내에서 Conventional/Tissue-specific/Inducible 하게 발현되도록 하여 연구 목적을 달성합니다.
일반적으로 U6/H1을 사용하여 shRNA을 발현하도록 하며 타겟 시퀀스를 설계하여 shRNA 벡터를 제작하여 microinjection으로 shRNA벡터를 수정란에 주입합니다. 유전자 발현 과정에 shRNA의 방해 작용으로 타겟 유전자의 발현을 침묵 억제시키며 유전자 기능을 연구할 수 있습니다.
벡터를 수정란에 microinjection하여 microRNA의 과발현 혹은 억제 할 수 있습니다.
프로모터-lox-stop-lox-TG유전자 벡터를 제작 후 microinjection하여 조직특이성 마우스 모델을 제작합니다. 일반적으로는 TG 유전자는 발현하지 않으며 Cre/CreERT2 마우스와 브리딩하면 stop 시퀀스가 삭제되어 TG 유전자가 특정된 조직에서 발현이 가능합니다.
Bacterial artificial chromosomes(BACs)은 Large Fragment DNA를 조작하는 중요한 수단입니다. 유전자의 완전성때문에 유전자 변형의 중요한 기능을 더 잘 설명할 수 있습니다. 따라서 완전한 시공간 특이성 유전자 발현, 유전자 구조 및 regulatory element 등을 연구하기 위해 BAC에서 직접 Pronuclear Microinjection(약 수십~수백Kb)을 하거나 이를 개조해 마우스의 수정란에 주입해 유전자 변형 마우스를 얻을 수 있습니다.
1. Pronuclear Microinjection은 타겟 유전자를 랜덤으로 마우스 또는 랫드 유전자에 삽입하기 때문에 생산한 1세대 F0 마우스는 삽입 위치가 다른 여러가지 마우스를 얻을 수 있습니다. 타겟 유전자의 발현량도 다릅니다. 그리고 생산한 1세대 F0 마우스를 단독 line으로 보고 같은 line끼리 브리딩을 진행하여야 합니다. 또한 외부 유전자는 diploid 동물에서 하나의 염색체에만 삽입할 수 있기 때문에 hemizygote이며 후대 중 일부 개체만 hemizygote이므로 선별검증이 필요합니다.
2. Pronuclear Microinjection 후에 PCR양성 F0 heterozygous 마우스를 얻습니다.
3. F0 마우스가 성숙된 후에(8주령) 야생형 마우스와 교배하여 F1 마우스를 생산합니다.
4. 생산한 F1 마우스를 유전자 검사를 통하여 선별해 냅니다. 이론상 F1 세대 마우스 중 50%는 heterozygote이고 50%는 야생형입니다.
주의 사항:
1) F0 마우스마다 유전자형이 다르기 때문에 F0 사이에 브리딩 할 수 없고 야생형하고만 브리딩 할 수 있으며 유전자형이 일치한 F1 마우스를 선별해야 합니다.
2) F1 마우스를 얻은 후, 단백질 발현 검사를 진행하여 발현이 안정적인 마우스를 선별하여 계속 브리딩을 진행해야 합니다.