CRISPR-Pro Knock-Out / Konck-In Rat

CRISPR-Pro Conventional Knock-Out Rat란 CRISPR- pro Gene Knockout 기술을 통하여 target gene에 대응하는 gRNA와 cas9을 design 및 구축함으로써 target gene 기능 구역을 제거함으로써 target gene이 전신의 모든 조직 및 세포에서 발현되지 않는 래트 모델을 말합니다.

CRISPR-Pro Conventional Knockout은 Frameshift mutation, Fragment knockout, Doubel/Polygenic knockout으로 나누어져 있습니다.

Breeding Scheme Of Frameshift Mutation Rat

1. Target gene에 대응하는 gRNA plasmid를 design 및 구축하며 체외에서 RNA로 전사시킨 후 Cas9 mRNA와 같이 원핵에 미세주입한 후에 sequence analysis 결과가 양성인 F0 generation heterozygous 래트를 생산합니다.

2. F0 generation heterozygous 래트를 wildtype 래트와 교배시켜 PCR 및sequence analysis 결과가 양성인 F1 generation heterozygous 래트를 생산합니다.

3. 동일한 F0 generation래트를 통하여 생산한 유전자형이 일치한 F1 generation 래트를 선별하며 성성숙된 후 서로 교배를 시키면 F2 generation 래트를 생산합니다. 그리고 생산된 F2 generation 래트에 대하여 PCR 및sequence analysis를 진행합니다. 이론적으로 F2 generation 래트 중에서 25%는 homozygous 래트이고 50%는 heterozygous 래트이며, 나머지 25%는 wildtype 래트입니다.

Breeding Scheme Of Fragment Knock-Out Rat

1. Target gene의 서로 다른 위치에 대응하는 한쌍의 gRNA plasmid를 design 및 구축하며 체외에서 RNA로 전사시킨 후, Cas9 mRNA와 같이 원핵에 미세주입한 후에 sequence analysis 결과가 양성인 F0 generation heterozygous 래트를 생산합니다.

2. F0 generation heterozygous 래트를 wildtype 래트와 교배시켜 PCR 및sequence analysis 결과가 양성인 F1 generation heterozygous 래트를 생산합니다.

3. 동일한 F0 generation래트를 통하여 생산한 유전자형이 일치한 F1 generation 래트를 선별하며 성성숙된 후 서로 교배를 시키면 F2 generation 래트를 생산합니다. 그리고 생산된 F2 generation 래트에 대하여 PCR 및sequence analysis를 진행합니다. 이론적으로 F2 generation 래트 중에서 25%는 homozygous 래트이고 50%는 heterozygous 래트이며, 나머지 25%는 wildtype래트입니다.

Breeding Scheme Of Doubel/Polygenic Knock-Out Rat

1. 두개의 target gene에각각 대응하는 한쌍의 gRNA plasmid를 design 및 구축하며 체외에서 RNA로 전사시킨 후 Cas9 mRNA와 같이 원핵에 미세주입한 후에 sequence analysis 결과가 양성인 F0 generation polygenicheterozygous래트를 생산합니다.

2. F0 generation heterozygous 래트를 wildtype 마우스와 교배시켜 PCR 및sequence analysis 결과가 양성인 F1 generation double geneheterozygous 래트를 생산합니다.

3. Double geneheterozygous 래트를 서로 교배시킨 후 생산된 F2 generation 래트에 대하여 PCR 및sequence analysis를 진행합니다.

Conditional Knock-Out은 target gene의 한개 또는 여러개의 중요한 exons 양쪽에LoxP site를 삽입함으로써 floxed 래트를 만드는 것입니다. 이 floxed 래트가 cre-expressing 래트와 교배하기 전에 target gene은 완전히 정상적으로 발현되고 tissue-specific cre-expressing 래트와 교배를 진행 후 target gene은 특정 조직 또는 세포에서 knockout될 수 있으며 다른 조직이나 세포에서 정상적으로 발현됩니다.

Breeding Scheme 

1. Wildtype 래트와 교배: 양성CRISPR-Pro 래트(+/flox)와 wildtype 래트(+/+)를 교배시켜 F1 generationheterozygous 래트(+/flox)를 생산합니다.

2. F1 generationheterozygous 래트(+/flox) 한 쌍을 선별하여 inbreeding시키며 F2 generation homozygous 래트(flox/flox)를 생산합니다.

CRISPR-Pro Knockin이란 CRISPR- pro gene knockin 기술을 이용하여 target gene 에 대응하는 gRNA와 donor vector를 design 및 구축하며, Cas9뉴클레아제 가위 작용 및 상동재조합을 통하여 특정된 외부 유전자를 삽입하는 기술입니다. 예를 들어, target gene에 포인트 뮤테이션(인간 유전 질환 모델 시뮬레이션)을 도입하거나, homologous recombination을 통해 reporter gene (EGFP, mRFP, mCherry, mYFP 또는 LacZ 등)을 target gene의 특정 부위에 도입함으로써 reporter gene을 통해 target gene의 발현을 추적할 수 있습니다. 또한, KO/KI가 동시에 발생하도록 래트 자체의 유전자를 reporter gene으로 대체 할 수도 있습니다.

CRISPR-Pro Knock-In Rat는 Point Mutation Rat, Fragment Gene Knock-In Rat로 나누어져 있습니다.

Breeding Scheme Of Point Mutation Rat

1. Target gene에 대응하는 gRNA plasmid를 design 및 구축하며 RNA로 전사시킵니다. 그 다음에 돌연변이 위치 정보가 포함된 donor oligo를 합성하여 Cas9 mRNA와 같이 원핵에 미세주입한 후에 sequence analysis 결과가 양성인 F0 generation heterozygous 래트를 생산합니다.

2. F0 generationheterozygous 래트를 wildtype 래트와 교배시켜 PCR 및sequence analysis 결과가 양성인 F1 generation heterozygous 래트를 생산합니다.

3. 동일한 F0 generation래트를 통하여 생산한 knockin 위치가 일치한 F1 generation 래트를 선별하며 성성숙된 후 서로 교배를 시키면 F2 generation 래트를 생산합니다. 그리고 생산된 F2 generation 래트에 대하여 PCR 및sequence analysis를 진행합니다. 이론적으로 F2 generation 래트 중에서 25%는 knockin 위치가 일치한 homozygous 래트이고 50%는 염색체 하나만 knockin된 heterozygous 래트이며, 나머지 25%는 wildtype래트입니다.

 Breeding Scheme Of Fragment Gene Knock-In Rat

1. Target gene에 대응하는 gRNA plasmid와 돌연변이 위치 정보가 포함된 donor vector를 design 및 구축하며 mRNA로 전사시킨 후 Cas9 mRNA와 같이 원핵에 미세주입한 후에 sequence analysis 결과가 양성인 F0 generation 래트를 생산합니다.

2. F0 generationheterozygous 래트를 wildtype 래트와 교배시켜 PCR 및sequence analysis 결과 유전자가 무작위로 삽입된 F1 generation heterozygous 래트를 생산합니다.

3. 동일한 F0 generation래트를 통하여 생산한 knockin 위치가 일치한 F1 generation 래트를 선별하며 성성숙된 후 서로 교배를 시키면 F2 generation 래트를 생산합니다. 그리고 생산된 F2 generation 래트에 대하여 PCR 및sequence analysis를 진행합니다. 이론적으로 F2 generation 래트 중에서 25%는 knockin 위치가 일치한 homozygous 래트이고 50%는 염색체 하나만 knockin된 heterozygous 래트이며, 나머지 25%는 wildtype래트입니다.

ROSA26 Knock-In Rat란 Rosa26위치에 어떤 유전자를 삽입하는 Knock-In 래트 모델을 말합니다. (형질 전환 래트 모델이라고도 함). ROSA26 Knock-In 래트 모델은 정확한 삽입 위치를 가질뿐만 아니라, Rosa26은 안전 구역이기 때문에 외부 유전자가 이 위치에 삽입하더라도 다른 유전자의 발현에 영향을 미치지 않을 것입니다. 또한 single-copy 유전자를 삽입함으로 발현량을 더 쉽게 예측할 수 있습니다. Cre-loxP 시스템과 결합하면 특정 조직 및 특정 시간에 외부 유전자를 안정적으로 발현시킬 수 있으며 다목적 Conditional Knock-In Rat를 효율적으로 구축 할 수 있음으로 점점 더 많은 연구자들의 관심을 받고 있습니다.

Principle Of Building:

ROSA26 Knock-In Rat(CRISPR-Pro 기술을 기반으로 함)

ROSA26 Conditional Knock-In Rat(CRISPR-Pro 기술을 기반으로 함)

기술 장점:

1. 외부 유전자의 재조합 위치가 확정됨으르써 발현에 더욱 유리합니다.

2. Cre-loxP시스템과 결합하면 외부 유전자를 특정 조직 및 특정 시간에 발현시킬 수 있습니다.

Rosa26은 고전적인 유전자 삽입 위치로, Rosa26 locus에 대한 연구가 많지만 다중 유전자 삽입 래트를 제작할 때 다른 적합한 삽입 위치가 여전히 필요합니다. H11(Hipp11)은 또 다른 선택 가능한 삽입 위치이자 하나의 안전 구역으로, 이 위치에 삽입된 유전자는 다른 유전자의 발현에 영향을 미치지 않으며, 또한 이 삽입된 유전자의 발현은 주변 구역의 영향을 받지 않습니다.

H11은 래트 11번 염색체에 있으며, 두 유전자 Eif4enif1과 Drg1 사이에 위치한 하나의 유전자로,  2010년에 Hippenmeyer S.에 의해 발견되었고 H11에 통합된 외부 유전자가 안정적이고 효율적으로 발현될 수 있습니다. CRISPR- pro 유전자 편집 기술을 이용하여 외부 유전자 fragment를 래트 H11 위치에 삽입할 수 있습니다. Rosa26과 비교할 때, H11은 옆에 있는 프로모터의 영향을 받지 않는다는 장점이 있기 때문에 외부 유전자 발현에 더 적합합니다. loxp 시스템과 결합하면 Tissue-specific 래트 모델을 구축할 수 있습니다.

Principle Of Building:

기술 장점:

1. 안정적이고 후대의 발현이 일치합니다.

2. 실용적이고 유전자 A가 Rosa26 위치의 과발현 및 유전자 B가 H11 위치의 과발현을 동시에 이루어질 수 있습니다.

3. 경제적이고 F1 generation부터 실험 진행이 가능합니다.