후편——렌티바이러스 패키징,당신이 가장 관심있는 문제입니까?

LV(Lentivirus) 는 인간 면역 결함 바이러스 (HIV) 에서 개조한 일종의 바이러스 벡터로 역전사 바이러스에 속한다. 렌티바이러스는 특정 유전자 조각을 무작위로, 안정적으로 숙주세포의 게놈에 통합할 수 있으며, 목적 유전자의 지속적이고 안정적인 발현 목적의 산물을 실현한다. 따라서 현재 느린 바이러스 벡터는 과표현, 간섭, 유전자 녹아웃과 같은 유전자 표현 조절에 널리 사용되고 있다.

그러나 바이러스 패키징 실험을 할 때, 과학 연구자들은 자주 문제를 겪는데, Cyagen에서 다년간의 분자생물학과 세포생물학 관련 실험기술 연구 경험을 가진 세포생물학 제품 매니저는 흔히 볼 수 있는 문제에 대해 렌티바이러스 패키징 FAQ를 정리했다. 렌티바이러스 패키지에 대한 당신의 당혹스러움을 풀었으면 한다. 전편 회고담은 여기 클릭해 주십시오: 전편—렌티바이러스, 당신이 가장 관심있는 문제입니까? 오늘은 렌티바이러스의 패키징에서 흔히 볼 수 있는 퀴즈를 이어서 풀어보겠습니다.

렌티바이러스 벡터는 최대 얼마나 큰 조각을 삽입할 수 있습니까?

렌티바이러스 벡터의 적재량은 6-6.5kb 정도이지만 일반적으로 삽입 권장되는 단편 크기는 5kb를 넘지 않다. 이렇게 패키징된 바이러스는 비교적 역가가 높다. 6kb를 넘으면 바이러스 역가가 현저히 떨어진다. 실제 바이러스 패키징에는 보고 유전자(예: GFP)와 내성 유전자(예: Puro)를 삽입해야 하는데, 이는 목적지 조각의 용량을 3kb 정도로 더욱 줄였다.

우리는 현재 벡터 최적화를 통해 예를 들어 불필요한 유전자를 지우고 프로모터의 길이를 줄이면 목적 유전자의 조각 용량을 4kb 정도로 늘릴 수 있다.

어떻게 나의 세포가 얼마나 많은 바이러스의 양을 필요로 하는지 확인하면 충분합니까? 그렇게 많은 규격을 내가 어떻게 선택해야 합니까?

렌티바이러스는 감염 스펙트럼이 넓기 때문에 분열기와 비분열기의 세포를 감염시킬 수 있다. 대부분의 세포 유형에 대하여 1×108 TU/ml의 규격으로 요구 사항을 충족한다. 또 현재 렌티바이러스는 체외세포 감염에 많이 쓰이고 체내 주사에는 적게 쓰이기 때문에 비순화도 가능한다.

감염이 어려운 세포, 예를들어, 원세대 세포(primary culture cell)는 높은 MOI가 필요한다. 필요한 바이러스 양도 많다. 1×108 TU/ml와 같은 높은 사양을 권장한다.

비교적 보기 드문 세포 유형에 필요한 바이러스의 양은 참고 문헌이나 사전 실험을 통해 알 수 있다.

당신들은 어떤 방법으로 바이러스 역가를 측정합니까? 믿을 수 있나요?

전편에서 다루듯이 렌티바이러스 역가의 측정 방법은 주로 4가지이다. 즉, Elisa법은 바이러스 입자의 p24단백질을 검출한다. PCR법은 바이러스 입자 RNA와 유전자 그룹에 통합된 바이러스 DNA를 검출하고 FACS를 통해 형광 단백질 발현 수준을 검출한다.

세포(293T) 게놈에 통합된 바이러스 DNA를 정량적 PCR로 검사하는 방법이다. 이 방법은 검출 결과가 비교적 정확한다. ELISA와 바이러스 RNA를 검출하는 방법은 바이러스 입자의 양만 검출하기 때문이다. 비활성화된 바이러스 입자를 포함하며, 이는 역가 검사 결과를 높게 할 수 있다. 우리의 실험은 트랜스펙션(transfection) 작용을 위해 활성형 렌티바이러스가 있어야 가능한다. FACS법에 의해 검출된 형광 단백질은 프로모터와 형광 단백질의 목적 세포 표현 수준에 영향을 받아 검출 결과가 낮다.

모두 세포를 트랜스펙션(transfection)할 수 있고 LV와 AdV 중 어느 것을 고르시겠습니까?

렌티바이러스는 세포 게놈을 삽입할 수 있기 때문에 목적 유전자의 지속적이고 안정적인 장시간 표현이 가능한다. 아데노바이러스는 게놈에 통합되지 않아 렌티바이러스에 비해 표현기간이 짧다. 보통 2, 3주 정도 걸린다.

아데노바이러스의 감염 효율은 매우 높으며 렌티바이러스보다 현저하게 높다. 대부분의 세포는 감염 효율이 평균 95% 이상에 이를 수 있다. 그래서 아데노바이러스의 사용을 고려해 볼 수 있다.

렌티바이러스는 패키징 주기가 비교적 짧다. 보통 한 달 반 정도이지만 패키징된 바이러스 역가도 비교적 낮다. (일반적으로 108 TU/ml). 아데노바이러스의 패키징은 비교적 번거롭다. 보통 2개월 이상 소요된다. 보통 1010 PFU/ml 이상, 순화된 후 1012 PFU/ml에 이를 수 있다. 또한 순화된 아데노바이러스는 직접 체내에 투여할 수 있지만 면역원성은 비교적 높다.우리는 양자의 특성에 따라 종합적으로 선택해야 한다.

만약 내가 당신 회사에서 바이러스 패키징을 하려면 무엇을 제공해야 합니까?

(1) 유전자의 ID와 서열:

(2) 필요한 바이러스의 역가 및 총량(우리는 1×108 TU/ml 이상의 다양한 규격과 옵션을 가지고 있다), 그리고 순화가 필요합니까?

(3) (꼭 필요하지 않다) 실험 목적 및 바이러스를 이용한 하위 실험을 준비하면, 우리는 당신의 필요에 따라 방안을 쉽게 만들 수 있다.

LV는 얼마나 자주 받을 수 있습니까? 받은 후에 어떻게 저장합니까?

일반적으로 렌티바이러스 패키징 전 과정은 벡터 구축(2~3주), 바이러스 패키징+증폭(1~2주), 검측(약 1~2주)가 잘 되면 4주 정도, 늦으면 6주를 넘기지 않는다.

바이러스를 받은 후 장기간 보관하려면 -80℃ 냉장고에 넣어두어야 한다. 1년 정도 보관할 수 있다. 일주일 안에 다 쓸 수 있다면 4℃ 냉장고에 넣어두면 된다. 렌티바이러스는 가급적 반복적인 동융을 피해야 하며 이론적으로 한 번 동융하면 바이러스 활성이 510% 정도 떨어지기 때문에 동융된 바이러스는 사용 전 다시 역가 검사를 하거나 분장을 고려해 사용하는 것이 좋다.

이상은 바이러스 패키지 실험 중 과학 연구자들이 자주 부딪히는 문제와 해답이다. 여러분들에게 도움이 되기를 바랍니다. 세포 유전자 편집 실험에서 당신은 또 어떤 문제와 고민이 있습니까? 우리에게 메시지를 남기신 것을 환영합니다!

Cyagen는 15년간 세포기술 서비스 분야에 집중해 성숙하고 안정적인 유전자 발현 조절 실험 플랫폼을 갖추고 있다. 다양한 종류의 다른 세포(어려운 전염 transfection 세포 포함)를 대상으로 유전자 과발현/교란 안정적 세포주 구축 서비스를 제공하며 수천 건의 성공 아이템을 보유하고 있다!

About Cyagen

Cyagen바이오는 2006년 설립된 AI 기술을 활용한 약물 개발 혁신 CRO 회사다.현재 직원 수가 900명을 초과하고, 총 규모는 40,000제곱미터를 초과하며, 중국 광저우,쑤저우,베이징구안(固安)에 완전 자본 자회사를 설립하고 있다. 청두, 베이징, 상하이, 우한, 창사 등에 사무소를 두고 있으며 미국 Santa Clara와 일본 도쿄에 지사를 두고 있다. 지난 10여 년 동안, Cyagen 바이오는 품계의 풍부한 유전자 편집 마우스 자원 라이브러리, 효율적이고 지능화된 Mouse와 Rat맞춤형 플랫폼, 규모화된 빠른생육 플랫폼, 그리고 엄격한 품질 제어를 위한 무균 마우스 기술 서비스 플랫폼에 의존하여 모델 동물 유전자 편집 기술 분야에서 업계 선두에 서고 있으며, 또한 대량의 생체 정보 및 유전자 편집 분야의 데이터를 축적하고 있다.

인공지능 분야의 심도있는 탐색을 결합하여 Cyagen 바이오는 유전자 치료와 세포 치료를 하는 연구자에게 원스톱 솔루션을 제공하고 AI 표적 선별 및 기능 연구,동물 모델 구축, 치료적 벡터 설계 및 최적화,바이러스 포장, 약리 약효학 연구 등 전 프로세스 서비스를 원스톱으로 제공하여 유전자 치료와 세포 치료 기초 연구의 임상 전환 효율을 높이는 데 도움을 줄 수 있다. 현재 Cyagen바이오는 전 세계 100여 개국의 과학자 및 기업체와 광범위한 협력을 맺고 과학연구기관 및 의약산업에 종합적인 동물모델 제작, 생육보종, AI 표적선별, 약리 약효평가, 유전자치료와 세포치료 분야의 과학연구와 임상전환 등의 서비스를 제공하는 데 주력하고 있다. 필요하시면 문의 연락 주세요.