전편——렌티바이러스 패키징,당신이 가장 관심있는 문제입니까?

LV(Lentivirus) 는 인간 면역 결함 바이러스 (HIV) 에서 개조한 일종의 바이러스 벡터로 역전사 바이러스에 속한다. 렌티바이러스는 특정 유전자 조각을 무작위로, 안정적으로 숙주세포의 게놈에 통합할 수 있으며, 목적 유전자의 지속적이고 안정적인 발현 목적의 산물을 실현한다. 따라서 현재 느린 바이러스 벡터는 과표현, 간섭, 유전자 녹아웃과 같은 유전자 표현 조절에 널리 사용되고 있다.

그러나 바이러스 패키징 실험을 할 때, 과학 연구자들은 자주 문제를 겪는데, 예를 들어 왜 나의 LV패키지에서 독성이 매우 낮습니까? 패키징된 LV 감염 세포는 효율이 낮다?세포감염 후 성장상태 불량 등. 다음은 Cyagen의 생물세포 생물학 제품 매니저가 여러분에게 이 흔한 질문들에 대한 해답을 드리겠습니다.

왜 내 LV 패키징은 독성이 낮을까? 

왜 똑같은 렌티바이러스 시스템으로 패키지해서 남들이 성공률이 그렇게 높다? 내 건 역가(Titer)떨어지는 거 아니면 안정성이 떨어진다?

1) 세포 상태: LV의 패키징은 일반적으로 293T 세포를 사용한다. 293T 세포의 활력, 성장 상태, 로그 성장기 여부, 판넬의 균일한 여부 등 바이러스의 생산량에 큰 영향을 미친다. 또한 염색 전 밀도를 50~60%로 조절한다.

 2) 목적 유전자: 목적 유전자의 크기, 서열 및 번역된 단백질의 독성 여부는 패키징 효과에 영향을 줄 수 있다.예를 들어, 목적의 조각이 클 경우(>2.5k) 패키징 역가 떨어지거나 패키징되지 않을 수 있다. 

어떤 과표현으로 세포독성이 생기는 단백질이 세포 이상을 초래하여 독성이 낮을 수 있다. (아데노바이러스로 교체를 고려할 수 있다).

3) 플라스미드 질량: 음성 대조(GFP 조)를 잘 만들어 패키징 목적 유전자의 벡터 구축 완전성을 확보하고 순화를 잘한다.

 4) 독극물 수집 시기: 전염 후 24, 48h에서 세포 성장 상태 및 형광 상태를 관찰한다. 성장 상태가 좋은 것은 보통 48h에 1차적으로 상액 중의 바이러스를 수집하고, 환액 후 72h에 다시 상액 중의 바이러스를 수집한다.

패키징된 LV 감염 세포는 효율이 낮다?

이론적으로 LV 는 세포를 감염시키는 능력이 매우 강하며, 분열기와 비분열기의 세포를 감염시킬 수 있다. 그런데도 왜 감염효과가 잘 안 되는 걸까? 대체 LV 감염의 효과에 영향을 미치는 요인은 무엇일까?

1) 세포 유형: 어떤 세포는 그 자체로 감염되기 어렵다. 어떤 원대 세포는 바이러스의 양을 증가시키거나 농축 바이러스를 사용하여 감염시키는 것을 고려할 수 있다.

2）세포 성장상태: 세포를 감염시키기 전에 세포가 양호한 성장 상태와 적당한 성장 밀도를 보장해야 한다. 세포막의 유동성, 세포표면과의 접촉면적 및 표면 수용체의 표현이 풍부한 것은 바이러스 감염세포의 효과에 영향을 줄 수 있다. 또 부유성 세포(suspension cell)의 경우 원심감염 방법을 사용할 수 있다.

3) 바이러스 품질: 패키징된 LV는 가급적 동융을 피해야 하며, 동융을 반복하면 바이러스의 역가(Titer)가 떨어질 수 있다 (매번 약 10% 감소). 한 번에 다 사용하지 않으면 분장하여 -80℃에 저장하는 것을 권장한다. 단 -80℃에서도 6개월 이상 권장하지 않는다.4℃에서 보관한 LV에 대해서는 가급적 3일 이내에 다 사용한다.

또한 Polybrene 에 가입하여 시약 감염 효과를 높이는 것도 고려해 볼 수 있다. 그러나 Polybrene은 그 자체로 세포독성이 있어 사용을 자제한다.

세포 감염 후 성장 상태가 나쁘다?

우리는 후속 기능 연구를 위해 LV 로 세포를 감염시켰다. 그 결과 감염 후 세포의 성장 상태가 매우 나빠서 실험을 계속할 수 없었다. 이게 무슨 이유죠? 무슨 방법이 있을까요?

1) 바이러스 순화: 바이러스 용액에 남아있는 불순물 단백질, 내독소 및 숙주세포 DNA 등은 세포독성을 일으킬 수 있으며 심하면 세포가 죽을 수 있다.

2) 바이러스 역가(titer) 조절: MOI 값은 LV 감염 실험에서 매우 중요한 지표다. 우리는 세포 상태에 영향을 받지 않도록 가능한 최소 바이러스 양을 확보해야 한다. 바이러스에 민감한 어떤 세포는 과도한 역가가 세포의 상태에 심각한 영향을 줄 수 있다. 바이러스 감염에 대한 최적의 MOI 값을 사전 실험을 통해 확인할 수 있다.

3) 외부 유전자의 과잉 발현: 만약 지나친 감염으로 인해 외부 유전자가 과도하게 발현된다면 목적세포 대사의 불균형을 초래하여 성장상태에 영향을 줄 수 있다.

어떻게 렌티바이러스 MOI 값을 확정합니까?

MOI는 감염 복수로, 일반적으로 세포가 80%에 감염될 때 사용하는 바이러스 입자 수와 세포 수의 비율을 이 세포의 MOI로 한다. MOI값=바이러스 역가(TU/mL)×바이러스 체적(mL)/세포 개수

1）문헌을 찾다: MOI값은 고분양 문헌 보도를 통해 확정된다.

2) 설계 계단식 사전 실험 모색: 문헌 추천의 그라데이션(gradient)을 기준으로 하고 상하 각 2 그라데이션(gradient) 설치한다. 각 경사도(gradient)는 최소 두 배 차이가 난다. 예를 들어 문헌의 권장 MOI 값이 8이면 2-4-8-16-32로 설정된다.

3) 그라데이션(gradient)감염 후에는 세포 상태가 비교적 좋고 형광도 많거나 약물 스크리닝 후 세포 생존율이 높은 그라데이션을 MOI값으로 사용한다.

어떻게 렌티바이러스 역가를 검사합니까?

Titer: 단위 부피 중 감염 능력이 있는 바이러스의 수. 단위: TU/mL(활성 titer 단위)

일반적으로 LV 역가(titer) 검사: 정확할수록 시간이 더 걸린다. 절약하면 할수록 정확하지 않다. 모든 실험 요구 사항에 따라 정밀 검사가 필요한 것은 아니다. 예를 들어 유전자 발현 또는 교란 발현(shRNA)을 하는 세포주를 구축하는 경우, 후속적으로 선별하는 과정이 있기 때문에 신속 검사법(죽은 바이러스도 검출된다)을 채택할 수 있다.

LV역가의 빠른 검출에는 QPCR, ELISA, 시험지법이 포함된다. 그 차이는 QPCR법: 바이러스의 핵산 검출량; ELISA법: 바이러스의 외피단백질(capsid protein)량 검출; 시험지법: 바이러스 p24의 외피단백질(capsid protein)량을 검출한다.

RNAi-screening 이나 CRISPR-screening 과 같은 연구의 경우 LV 의 역가를 정확하게 검측해야 한다. 형광 보고 유전자법과 항생제 선별법을 포함한다.

왜 내가 LV 를 유전자로 사용하는 간섭 표현 효과가 좋지 않은가?

렌티바이러스를 교란하는 경우, 바이러스의 양을 늘리는 것은 일반적으로 간섭 효과에 대한 개선 효과가 없다. 교란 효과의 차이는 일반적으로 다음과 같은 원인에 의해 발생한다.

1) shRNA의 특이성: shRNA 디자인으로 인한 탈표적 효과로 shRNA를 새롭게 디자인한다.

2) 간섭 메커니즘: mRNA 분해 촉진 또는 번역 억제?

3) 세포 피드백 메카니즘: 어떤 유전자 발현 수준이 낮아지면 리보솜의 번역 효율이 상승하고 발현 수준이 상승한다.

4) 결과 판독은 단백질의 기준으로 한다.

LV는 과표현의 효과가 좋지 않은가?

우리가 LV로 과표현했을 때, 다음과 같은 두 가지 경우가 있다.

1) 목적 세포에는 형광 신호가 없지만 평행 293 세포에는 신호가 있다. 이 경우 가장 가능한 원인은 세포들이 쉽게 감염지 못하기 때문에 어려운 감염 세포에 속하므로 바이러스의 양을 적당히 늘려 다시 시도해 보는 것이 좋다.

 2) 목적 세포는 형광을 가지고 있지만 목적 유전자 발현은 증강되지 않다. 트랜스펙션(transfection) 문제가 없는 것을 설명한다,형광 프로모터(Promoter)는 정상적으로 동작한다. 목적단백질과 형광단백질이 동일한 프로모터(Promoter)인지 아닌지를 포장하기 전에 프로모터(Promoter) 활성 선별을 할 수 있다. 또한, 목적 단백질이 세포에 독성이 있는지 여부를 고려하여 목적 단백질이 세포에 의해 분해되도록 한다.

또한 과표현 효과가 떨어지는 일반적인 처리 방법에는 바이러스 역가를 높이고, 벡터를 교체하고, 유전자 피드백 (세포 적응) 을 피하고, 유도 표현을 사용하는 방법이 있다.

LV 는 어떻게 여러 유전자를 동시에 표현합니까?

1）목적의 유전자 조각이 크지 않다면 쌍방향/많이 프로모터(Promoter)를 사용하여 각각 개별적으로 여러 개의 유전자를 작동시킬 수 있다.

2）목적 유전자 조각이 클 경우 단일 프로모터(Promoter)로 여러 유전자 발현(단백질 융합)을 할 수 있다. 

3) 서로 다른 유전자 사이에 IRES를 삽입한다.

4) 서로 다른 유전자 열린 해독틀에 프로테아제 스프라이싱 사이트(Splice site)를 삽입한다.

당신의 문제는 이미 해답을 받았습니까? 만약 당신이 또 다른 문제를 풀어야 할 것이 있다면, 저희에게 메시지를 남겨주시면 다음 번에 모두 풀도록 통일하겠습니다.

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