flox 마우스

flox 마우스란 어떤 유전자의 어떤 엑손 양쪽에 각각 LoxP 서열을 두는 것을 말한다. 이 서열이 바로 Flanked by LoxP이며 이를 flox 마우스라고 한다. 이와 같은 flox 마우스는 일반적으로 타겟팅 벡터의 설계 및 구축, 배아줄기세포 재조합, 낭배 현미주사, 키메라 마우스의 계대(繼代)를 통해 얻게 된다. 또한 이와 같은 마우스는 Cre 툴 마우스와 교배시킬 경우 Cre의 발현이 두 LoxP 위치 서열의 재조합을 유도함으로써 두 LoxP 사이의 서열이 녹아웃된다. 서로 다른 Cre 툴 마우스의 Cre 발현에 조직/세포 특이성이 있기 때문에 서로 다른 조직이나 세포(예: 상피세포, 흉선세포, T세포, B세포, 심근세포, 장, 폐 등)에서 타겟 유전자를 특이적으로 녹아웃하는 목적에 도달할 수 있다.

flox 마우스의 응용:

• 배아치사성 유전자의 유전자 녹아웃 마우스 제작 가능
• 특정 조직 또는 세포 내 타겟 유전자의 기능성 연구에 사용
• 다른 유도 시스템으로 Cre 또는 Flp 프로모터의 발현을 제어하고 시공에서 유전자 녹아웃 발생 제어도 실현 가능

flox 마우스의 제작 원리:

유전자 녹아웃은 1980년대 말부터 발전해 온 마우스 배아줄기세포의 높은 재조합 효율을 이용해 유전자를 녹아웃 또는 녹인하는 신종 분자생물학 기술이다.

일반적인 의미에서 유전자 녹아웃은 주로 DNA 상동 재조합 원리를 적용하여 설계된 상동 조각으로 표적 유전자 조각을 대체함으로써 유전자 녹아웃 목적에 달성한다.

flox 마우스의 제작 절차:

• 타겟팅 벡터의 설계와 구축

• ES 전기 천공과 단일 클론 선별 

• 양성 클론 Identify

• 세포 또는 낭배 현미주사

• 배낭을 거짓임신 암컷 마우스에 이식하여 키메라 혹은 F0 획득

• 키메라와 야생형 마우스 교잡으로 F1 세대 유전자 녹아웃 마우스 획득

flox 마우스의 검사 평가 방법:

• 벡터 Identify: 벡터 구축 완료 후 Enzyme digestion 및 시퀀싱 결과 제공.
• 트랜스펙션 성공 여부 판단: ES 약물 선별 및 단일 클론 선별.
• 벡터 조각 통합 여부 판단: ES 양성 클론 PCR 및 Southern Blot Identify 결과.
• 핵형 정확 여부 판단: 선별하여 얻은 양성 클론 ES 세포를 확대 배양 후, 반드시 단계별 핵형 검사를 해야 하며, 현미주사 진행 시에만 생식계가 전이된 키메라를 얻을 수 있다.
• Heterozygous 마우스 유전자형 판단: 마우스 꼬리를 잘라 DNA 추출하여 PCR 검사 및 시퀀싱을 분석한다.

조건부 녹아웃 마우스

조건부 유전자 녹아웃 마우스는 유전자 타겟팅을 통해 두 개의 loxP 위치를 타겟 유전자의 하나 또는 몇 개의 중요한 엑손 양쪽에 둔다. 이 마우스는 Cre 효소 발현 마우스와 교잡하기 전에 타겟 유전자의 발현이 아주 정상이다. Cre 효소를 조직 특이성으로 발현하는 마우스와 교잡 후 특정 조직이나 세포에서 해당 유전자를 녹아웃할 수 있으며 이 유전자는 다른 조직이나 세포에서의 발현이 정상이다.

조건부 유전자 녹아웃 마우스의 적용 범위:

• 배아 치사성 타겟 유전자의 연구에 사용;

• 특정 조직이나 세포에서 유전자의 생리병리 기능 연구에 사용;

• Cre 발현을 제어하는 다른 유도 시스템과 결합하여 어떤 유전자를 발현하는 동시에 시간과 공간 양쪽에서 동시 제어할 수도 있다.

조건부 유전자 녹아웃 마우스의 설계는 Cre/LoxP나 Flipe/Frt 원리를 이용했다. 이들은 모두 위치 특이성 재조합 효소 시스템이다. 아래에 Cre/LoxP 시스템을 예로 설명한다. 예를 들어, 녹아웃할 구간의 타겟 DNA 서열 양쪽 끝에 각각 loxP 서열을 두어 flox(flanked by loxP) 마우스를 얻게 된다. flox 마우스를 세포 특이성으로 Cre를 발현하는 마우스와 교배, 번식시켜 특정 세포에서 표적 유전자를 놋아웃한 마우스, 즉 조건부 유전자 녹아웃 마우스를 얻는다. 이밖에 Cre 발현을 제어하는 다른 유도 시스템(예: CreERT2)과 결합하면 어떤 유전자에 대해 시공간 양쪽 제어를 동시 실현할 수 있다.

>> 조건부 녹아웃(cKO) 마우스의 제작 방법?

Cre/loxP 시스템은 박테리오파지에서 유래되어 위치 특이성 DNA 재조합을 매개할 수 있다. 이 시스템은 두 개의 구성 성분을 포함하며 하나는 길이 34bp의 DNA 서열(LoxP 서열)이며, 2개의 13bp의 역방향 반복 서열과 하나의 8bp의 핵심 서열을 포함한다. LoxP의 방향은 중간 8개의 염기로 결정된다. 이 구간의 LoxP 서열이 Cre 재조합 효소가 인식하는 위치이다. 다른 한 구성 부분은 Cre 재조합 효소이다. 이는 박테리오파지 코드의 일종인 343개의 아미노산으로 구성된 단백질이다. Cre는 두 LoxP 위치 재조합을 유도하여 두 LoxP 사이의 DNA 서열 결핍을 유발할 수 있다. 만약 Cre 재조합 효소 cDNA를 유전자 공학 수단을 통해 조직이나 세포 특이성 프로모터 아래에 둘 경우 Cre 조직/세포 특이성 발현의 Cre 마우스를 얻을 수 있으며Cre 툴 마우스라고도 한다. flox 마우스와 교배 후 조건부 유전자 녹아웃 마우스를 얻을 수 있다.

>> 조건부 녹아웃 원리: Cre/loxP 시스템

Cyagen에서 조건부 녹아웃 마우스를 제공할 수 있으며 관심이 있으시면 연락 부탁드립니다.