녹아웃(KO) 마우스 | Cyagen Korea

유전자 치료란 유전자 발현을 수정 혹은 조작하거나 살아있는 세포의 생물학적 특성을 변화시켜 질환 치료 또는 완치의 목표를 실현하는 기술을 말한다. 유전자 치료는 유전자 변화가 일어나는 시기에 따라 체외(ex vivo)와 체내(in vivo) 두 가지 경로로 나뉜다. 체외는 체외에서 배양한 세포의 유전자를 복구하는 과정을 거쳐 복구된 세포를 다시 인체에 주입하는 것이며 체내는 유전자를 변화시킬 수 있는 물질을 직접 벡터를 통해 인체에 주입하는 것이다.

 

현재 유전자 치료 제품은 암, 유전병, 전염병 등을 포함한 다양한 질병의 치료에 쓰이고 있다. 유전자 치료의 발전은 인류의 질병 치료에 결정적인 희망을 가져다 주었다. 허나 실제로 인간에게 치료 방법을 적용하기전에 대량의 임상전 과학연구를 통해 그 기반을 다질 필요가 있다. 여기에는 체내 동물모델의 제작, 벡터의 선택, 치료 전략의 확정 등이 포함된다.

 

본문은 유전자 치료의 작용 메커니즘으로부터 시작하고 유전자 치료에서 동물 모델과 바이러스 벡터의 연구 사례를 결부하여,이 과제의 연구 단계에 있는 학자들에게 더 많은 구상과 아이디어를 제공한다.

 

1. 유전자 치료 - 체내 동물 모델의 제작

인간의 질환 모델동물은 생물의학의 과학연구를 통해 구축된 인간 질병과 유사성 표현이 있는 동물 실험 대상과 재료이다. 동물모델의 사용은 현대 생물의학 연구에서의 매우 중요한 실험 방법과 수단이며, 더욱 편리하고 효과적으로 인간 질환의 발생, 발전 규칙을 이해하고 예방 및 치료 조치를 연구하는데 도움이 된다. 현재 유전자 치료의 위험으로는 중증 면역반응(예: 사이토카인 폭풍), 신경독성, 돌연변이 삽입(종양성) 등을 포함하며 중증 면역반응은 단기간 내 환자의 생명을 위협할 수 있는 가장 흔한 부작용이다. 유전자 치료 과정에서 중증 면역반응의 발생을 줄이기 위해 실험 동물 모델의 선택이 특히 중요하다.

 

유전자 편집 기술로 제작한 동물모델은 인체 내 생리, 병리 환경을 잘 시뮬레이션할 수 있고 또 일부 질병의 변화까지 시뮬레이션할 수 있어 질병의 발생 과정과의 일치성이 매우 높다. 임상전 연구에서는 동물 모델의 전체 수준에서 유전자 치료 실험을 통해 유전자 치료 방안의 타당성, 유효성, 안전성 및 면역 반응에 대한 평가를 완성할 수 있어 임상 시험의 안전성과 신뢰성을 크게 향상시킬 수 있다.

 

물론 임상전 동물 연구에서 질병의 종류에 따라 유전자 편집 모델의 선택에 대한 고려도 서로 다르다. 유전자 결핍 또는 불활성화에 따른 질병에 가장 적합한 것은 유전자에서 상응한 돌연변이가 똑같이 발생하는 점 돌연변이 마우스나 인간화 마우스이다. 다만 유전자 녹아웃 또는 조건부 녹아웃(KO/cKO) 마우스도 적지 않은 연구 가치 가 있다. 이는 마우스에서의 점 돌연변이는 인간와 같은 유전자 기능의 온전한 상실이 발생하지 않을 수도 있으며 녹아웃을 통해야만 관련 질병의 관련 표현형을 얻을 수 있기 때문이다.

 

유전자 편집 기술 기반으로 하는 모델 제작

현재 유전자 편집은 유전자 치료 중에서 연구 열의가 가장 높고 응용 전망이 가장 넓은 기술이다. 이 기술은 유전자 편집 도구인 CRISPR, TALEN나 ZFN을 이용하여 세포의 DNA에 복구 유전자를 부위 특이적으로 삽입하여 무작위로 유전자를 삽입하는 위험을 피면하면서도 복구나 삽입을 통해 치료 효과의 지속성을 보장할 수 있다.

 

유전자 편집 기술이 발전함에 따라 그 편집효율과 정확성이 꾸준히 향상되고 있으며 그 응용분야도 끊임없이 확장되고 있다. 한편으로는 발현 조절과 유전자 기능 연구, 세포 동물 모델 제작, 암 유전자 및 약물 표적 선별 등에 사용될 수 있으며 다른 한편으로는 유전자 치료에서 아주 큰 발전 전망이 있다. 유전자 치료는 주로 정상 유전자를 도입하거나 결함 유전자를 편집, 복구하여 질병치료의 목적을 실현한다. 현재 유전자 편집 기술은 이미 다양한 질병, 예를 들어 단일 유전자 유전병, 안과 질병, 에이즈 및 종양 등의 유전자 치료에 응용되고 있다.

 

2. 유전자 치료 - 바이러스 벡터 선택

바이러스 벡터란 바이러스를 기초로 하는 유전자 벡터를 말한다. 구체적인 제조과정은 바이러스 유전체에 대한 조작과 개조를 진행하여 외인성 유전자와 관련 유전적 요소를 갖게 하고 바이러스 입자로 포장되게 하는 것이다. 외인성 유전자를 가진 바이러스 벡터가 바이러스 입자로 포장되면 유전자 송달계(gene delivery system)를 구성하게 된다. 대다수 야생형 바이러스는 유기체에 대해 병원성을 가지고 있기 때문에 이를 개조해야 인체에 사용할 수 있다. 바이러스의 다양성 및 유기체와의 복잡한 의존 관계로, 사람들은 지금까지도 많은 바이러스의 라이프 주기, 분자생물학 특성, 질병의 발생 및 발전과의 관계 등에 대한 인식이 전면적이지 못하여, 많은 바이러스가 실용적인 벡터로 발전하는 것을 제한하고 있다.

 

최근 20년 동안 몇 가지 바이러스, 예를 들어 역전사 바이러스(HIV 바이러스 포함), 렌티바이러스(lentivirus), 아데노 바이러스(adenovirus), 아데노연관바이러스(adeno-associated virus, AAV), 발진열 바이러스(단순포진바이러스, 백시니아바이러스 및 EB 바이러스 포함)가 성공적으로 유전자 전이 벡터로 개조되어 어느 정도의 응용이 전개되었다.

 

바이러스 종류

장점

단점

역전사 바이러스, 렌티바이러스

지속적인 발현, 감염세포 효율이 높고 면역반응이 낮음

유전자 단편을 즉시 삽입, 발암 위험이 있음

아데노 바이러스

유전자 단편 미삽입, 벡터 용량 큼

발현 지속성이 낮고 면역반응이 높음

아데노연관바이러스

유전자 단편 미삽입, 면역반응이 낮음

발현 지속성이 낮고 벡터 용량 작음

흔히 사용되는 유전자 벡터 비교

 

(1) 역전사 바이러스, 렌티바이러스: 이 두 종류의 바이러스는 인체 세포의 DNA에 정확한 유전자를 삽입할 수 있다. 단, 이와 같은 삽입은 무작위성이 비교적 크므로 기타 정상 유전자에 삽입할 경우 해당 유전자의 불활성화, 심지어 암을 초래할수 있다.

(2) 아데노 바이러스(adenovirus): 아데노바이러스 벡터는 유전자를 인체의 세포 DNA 에 삽입하지 않고, 가진 정확한 유전자를 벡터 자체 방식을 통해 인체의 세포 속에서 발현하므로 비교적 안전하다. 단, 아데노바이러스는 비교적 강한 면역반응을 일으킨다.

(3) 아데노연관바이러스(AAV): 아데노연관바이러스 벡터는 통상 유전자 단편을 인체 세포 DNA에 삽입하지 않으며 일으키는 면역반응도 비교적 낮다. 따라서 AAV는 현재 유전자 치료에 사용되는 주요 벡터이다.

 

(3) 사례 분석

동물모델과 바이러스 벡터가 유전자 치료에서의 연구 사례를 아래 간략하게 서술한다.

 

1) 유전자 편집을 이용한 가족성 고콜레스테롤혈증 치료

중국과학원 생물화학과 세포생물학연구소의 주빈(周斌) 과제팀과 교통대학 국제부녀아동보건원의 황하봉(黃荷鳳)팀은 Circulation에 “In Vivo AAV-CRISPR/Cas9-mediated Gene Editing Ameliorates Atherosclerosis in Familial Hypercholesterolemia”이라는 제목의 논문을 발표하였다. 논문에서는 AAV-CRISPR/Cas9 시스템이 Ldlr 돌연변이를 가진 마우스(Cyagen 구축)에 대한 LDLR 유전자 교정을 진행할 수 있고 부분적으로 LDLR 발현을 복구시키고 LDLR 돌연변이체 중의 죽상동맥경화증을 효과적으로 개선시킬 수 있어 가족성 고콜레스테롤혈증 환자의 치료에 잠재적인 치료 방법을 제공한다는 것을 발견했다.【1】

 

가족성 고콜레스테롤혈증(FH)은 가장 흔히 볼 수 있는 유전성 고지혈증이며 임상 징후로는 혈액 중 콜레스테롤 수치가 뚜렷하게 높아지고 초기 심혈관계 질병(예: 심근경색, 중풍) 등을 초래하며, 심할 경우 생명까지 위협한다. FH에서 가장 흔한(>90%) 유전자 결함은 저밀도지단백질 수용체를 코딩하는 LDLR 유전자 돌연변이에 의해 발생하며 LDLR 단백기능이 상실되면 순환계 내 저밀도지단백질 LDL의 축적을 초래한다. 이형접합자의 LDLR활성은 2~25% 이며, 일반적으로 스타틴계 약물을 사용하여 치료하나 동형접합자의 LDLR 단백질의 활성은 2% 미만으로 약물치료에 항시 반응이 없으며 영아기에도 중증 죽상동맥경화증 표현형과 각종 합병증이 나타날 수 있다. 동형접합자 FH에 대한 현재 치료 수단은 LDL 혈장교환과 간 이식 등을 포함하며 비용이 많이 들고 일정한 위험이 존재하므로 새로운 치료법의 지속적인 모색과 탐구는 아주 중요한 의의가 있다.

 

LdlrE208X 마우스에서 AAV-CRISPR/Cas9 시스템을 이용한 유전자 편집을 통해 일부 간세포의 Ldlr 돌연변이를 교정하였으며, Ldlr 단백질 발현이 부분적으로 회복되었다. 대조군에 비해 LDLR의 발현이 부분적으로 회복되더라도 고지방 식이요법 유도 후 대조군에 비해 치료군의 LdlrE208X 마우스는 죽상동맥경화의 증세가 현저하게 경감되고 대식세포 침윤, 지질 축적 등의 증세도 현저하게 완화되었으며 순환계통의 각종 지표도 뚜렷하게 개선된 사실을 연구팀이 발견했다. 동시에 연구팀은 CRISPR/Cas9 시스템의 off-target 효과와 일부 면역 지표도 검사하였으며 성체 마우스 체내에서 뚜렷한 off-target 및 면역거부 반응을 발견하지 못하였는 바, 이번 유전자 편집 치료의 유효성과 안전성을 입증하였다.

 

본 연구는 CRISPR/Cas9 시스템을 이용할 경우 가족성 고콜레스테롤혈증 유발 유전자를 표적 및 교정하여 죽상동맥경화증 등 관련 표현형을 현저하게 개선할수 있다는 것을 밝혀냈다. 향후 AAV가 제공하는 CRISPR/Cas9시스템을 유전성 심혈관계 질환 중 체세포의 유전자 돌연변이를 교정하여 질병 개선 또는 복구하는 데 사용할 수 있다.

 

2) 유전자 치료를 이용한 신경퇴행성 질환 연구

알츠하이머병(Alzheimer's disease,AD)은 진행성 신경퇴행성 질환으로 임상에서 기억과 인지 기능 장애, 언어·행동 능력 결핍으로 나타나며 후기에 환자는 심각한 기억상실증과 운동기능 약화로 결국 사망에 이르게 된다.

 

β 아밀로이드 단백질은 뇌에 있는 아밀로이드 응집의 주요 성분이며 알츠하이머병증 환자의 뇌에 있는 아밀로이드 응집이 쌓이면 환자의 뇌세포 사망을 유발할 수 있다. 이 또한 유전자 치료의 효과적인 전략을 시작하였으며, 예를 들어 바이러스 벡터를 가진 CRISPR/Cas9는 비정상 단백질의 생성을 변화시켜 그것의 축적을 제한한다. 많은 AD 유전자 감각 요인, 예를 들어 APOE와 PSEN은 AD발전의 관건적인 관여 구성 성분으로 분류되었으며 CRISPR/Cas9 시스템을 위해서도 잠재적인 표적을 개척했다.

 

스웨덴 웁살라대학의 Martin Ingelsson과 동료는 조기 상염색체 우성 유전의 알츠하이머병(AD)에 사용할 수 있는 CRISPR/Cas9로 환자의 세포와 마우스 아밀로이드전구체단백질을 교정한 스웨덴형 돌연변이(Appswe) 연구 성과를 최초로 발표하였다. 돌연변이의 Appswe 녹아웃으로 환자 세포에서 Aβ 발생을 줄이고 동시에 야생형 대립유전자가 온전히 유지되게 하였다. 동일한 전략으로 이들은 또 Appswe 대립유전자를 가진 유전자 변형 마우스의 유전체를 수정했으나 AD 병리에 영향을 주는지는 아직 확실치 않다. 이 연구 결과는 조기 AD 사례는 APPswe 파괴의 힘을 입을 수 있다는 것을 표명한다. 【2】

 

현재 알츠하이머병 치료는 여전히 많은 장애를 겪고 있으며 가장 기초적인 발병 분자 메커니즘을 포함해 우리는 충분히 알기에는 아직 갈 길이 멀다. 그렇다고 해서 불가능을 의미하는 것은 아니고, 좌절을 겪고 있는 AD 치료 분야에 있어서 유전자 치료는 여전히 신생 잠재력을 가지고 있으며 많은 가능성이 존재한다.

 

결론

질병 메커니즘과 효과적인 치료 표적에 대한 인류의 꾸준한 인식과 유전자 편집 기술의 업그레이드 및 발전에 따라 유전자 편집 치료 방안의 대규모 임상 적용이 가능해질 것이며 특히 희귀병, 유전성 질환 등 전통적인 치료로 치유가 어려운 질병을 치료하게 될 것이다. 유전자 편집을 통해 발병 유전자를 교정하거나 유익한 돌연변이를 도입하여 질병 치유 목적을 달성할 수 있다. 유전자 편집 기술의 임상 전환과 응용 연구도 미래 유전자 치료의 광범위한 응용과 연구의 관건이 될 것이다.

 

Cyagen은 모델 제작부터 바이러스 벡터의 패키징까지 유전자 치료의 원스톱 솔루션을 고객에게 제공할 수 있으므로 관심이 있는 경우 연락해주기 바란다.

 

 

References:

1. H Zhao, Y Li, L He, W Pu, W Yu, Y Li, YT Wu, C Xu, Y Wei, et al. In Vivo AAV-CRISPR/Cas9–Mediated Gene Editing Ameliorates Atherosclerosis in Familial Hypercholesterolemia. Circulation. 2020;141:67-79 DOI: 10.1161/CIRCULATIONAHA.119.042476

2. György B, Lööv C, Zaborowski MP, Takeda S, et al. CRISPR/Cas9 Mediated Disruption of the Swedish APP Allele as a Therapeutic Approach for Early-Onset Alzheimer's Disease. Mol Ther Nucleic Acids. 2018;11:429-440. DOI: 10.1016/j.omtn.2018.03.007.

 

 

 

 

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