녹아웃(KO) 마우스 | Cyagen Korea

최근 몇 년 동안 인간화 항체 제작의 급속한 발전과 함께, 유전자 변형 방법을 이용하여 인간 항체를 만들 수 있는 인간화 마우스의 제작은 항체 약물 개발에서 중요한 연구 분야가 되었습니다. 그러나 인간 항체 Ig 유전자는 매우 큰 게놈 영역을 포함하기 때문에 이러한 인간 항체 유전자 마우스를 제작하는 것도 매우 도전적입니다.  따라서 동물 모델, 특히 1Mb보다 큰 유전자의 경우, 큰 단편 인간 항체 유전자 삽입을 달성하는 것은 여전히 매우 어려운 일입니다.

 

인간 항체 개발을 위한 인간화 마우스 모델 생성의 기술 장벽을 돌파하는 방법?

Cyagen은 TurboKnockout®, RMCE와 BAC 기술을 사용하여 인간 항체 유전자를 발현하는 LFKI(large fragment knock-in) 인간화 마우스 모델을 생성할 수 있습니다.

 

Cyagen에 의해 성공적으로 제작 완료된 수천 개의 knock-in 마우스 모델 프로젝트의 데이터를 분석하여, 우리는 Cyagen의 유전자 편집 기술이 큰 게놈 영역 편집의 어려움을 극복하는 경험과 교훈을 얻었으며 이는 후속 프로젝트에 대한 참조를 제공합니다.

 

TurboKnockout® Gene Targeting 기술이란?

ES Cell 타겟팅 기술을 기반으로 한 TurboKnockout®Gene Targeting 기술은 gene modification이 정확하고 효과가 안정적이며 Off-target effect가 없습니다. 또한, ‘Chimera’ 단계를 거치지 않고, Neo를 스스로 제거하게 만들어 2세대의 번식 시간을 줄였습니다. 뉴클레아제 기술(TALEN/Cas9)이 성숙하기 전에 TurboKnockout 기술은 연구자들에게 최선의 선택이 될 것입니다. 특정 배아 발달 단계에서 micro-injection을 통해 TurboKnockout® ES Cell이 Endogenous ES Cell을 100% 대체하여 ‘chimera’ 단계를 건너뛰게 함으로써 mouse 생산 기간을 6~8개월로 단축시켰습니다. 또한 TurboKnockout®은 독특한 Self-deleting Neo Cassette를 적용하여 생산된 TurboKnockout® mouse를 다른 어떤 품종의 mouse와 교배시켜도 Neo를 100% 자체 제거하는 mouse를 생산할 수 있습니다. 즉, TurboKnockout® 기술은 ‘chimera’ 단계를 건너뛰게 해 줄 수 있음은 물론, Neo를 스스로 제거할 수 있는 Neo를 제거하는 heterozygous mouse를 빠르게 얻을 수 있습니다.

 

RMCE (Recombinase-Mediated Cassette Exchange) 및 BAC란?

Recombinase-Mediated Cassette Exchange(RMCE)는 부위 특이적 재조합을 구현하여 고등 진핵 게놈의 체계적이고 반복적인 변형을 달성합니다. RMCE(Recompinase-mediated cassette exchange) 접근법은 큰 유전자 단편의 삽입을 위한 강력한 도구로 조건부, 리포터 및 형질전환 마우스 모델을 효율적으로 생성하는 데 사용될 수 있습니다. RMCE는 관심있는 유전자의 효율적인 transfer를 제공하고, 인간화된 마우스 모델을 생성할 수 있도록 쉽게 조정되며 마우스에서 인간 발현 패턴을 재현합니다.

 

박테리아 인공 염색체 (BAC)는 300kb 이상의 exogenous DNA를 수용할 수 있는 low-copy벡터입니다. BAC 재조합을 통해 더 큰 유전자와 조절 서열이 도입될 수 있으며 이는 내인성 유전자의 발현 패턴에 더 가깝습니다.

 

Cyagen TurboKnockout®, RMCE 및 BAC 기술로 항체 약물 개발 프로세스 가속화

TurboKnockout® (ES) cell targeting 기술을 기반으로, 우리는 RMCE-based 기술(BAC 융합 및 3개의 targeting round 포함)을 사용하여 최대 300kb의 영역에 대한 LFKI (large-fragment knockin) 인간화 및 유전적 변형을 달성했습니다!

 

중요한 것은 ES 세포 수준에서 다단계 BAC 재구성을 통해 프로젝트 주기를 크게 단축할 수 있어 연구 시간과 프로젝트 비용을 크게 절감하고 항체 발견 속도를 높일 수 있다는 것입니다.

 

CRISPR/Cas9-mediated 유전자 편집과의 비교

현재 동물 모델 유전자 편집 기술은 크게 두 가지, ES Cell Targeting 기술과 CRISPR/Cas9 기술로 나뉩니다. CRISPR/Cas9 기술은 고효율, 빠르고 간편하며, 저렴하고 다양한 종에 사용될 수 있다는 장점이 있지만, 단점은 항상 예측할 수 없고 통제 불가능한 off-target 위험이 있으며 복잡한 유전자 변형 프로젝트에는 적용되지 않는다는 것입니다. 한편에 ES Cell Targeting 기술은 정확하고 Off-target effect가 없으며, 여러 복잡한 gene modification을 할 수 있을 뿐만 아니라 특허 분쟁 없다는 장점을 가지고 있습니다. Cyagen에서 출시한 ES Cell Targeting 기술을 기반으로 한 TurboKnockout® Gene Targeting 기술은 제작 기간을 1년에서 반년으로 또는 심지어 CRISPR 제작 기간과 거의 동일하게 줄였으며 비용도 함께 절감시켰습니다.

 

 

TurboKnockout®

CRISPR/Cas9 Gene Editing

Turnaround time

6-8 months

5-7 months

Approach

Homologous recombination in ESC by Cyagen’s TurboKnockout® technology

CRISPR/Cas9 nuclease mediated gene targeting by pronuclear injection

KI fragment size

Up to 300 kb*

Usually less than 5 kb

Self-deleting selection cassette

Yes
No need to breed to Flp deleter mice

N/A

Screening method

PCR + Southern blot

PCR + Sequencing

Patent Risks

N/A

High-risk

Off-target Effect

N/A

Yes

 

TurboKnockout 서비스의 장점

Large fragment gene-editing:

DNA 클론벡터의 용량 제한으로 인해, 유전자 변형 동물을 만드는 데에 사용된 exogenous DNA단편이 보통 30kb보다 작기 때문에 유전자 활성을 조절하는 일부 중요한 요소가 손실될 수밖에 없습니다. BAC는 300kb 이상의 exogenous DNA를 수용할 수 있으며 BAC 재조합을 통해 더 큰 유전자 및 조절 서열을 도입할 수 있어 내인성 유전자의 발현 패턴에 더 가깝습니다.

 

Off-target effect가 없음:

ES Cell 타겟팅 기술을 기반으로 한 TurboKnockout® Gene Targeting 기술은 gene modification이 정확하고 효과가 안정적이며 Off-target effect가 없습니다.

 

특허분쟁 없음:

CRISPR/Cas9 기술에 비해 TurboKnockout® 기술은 특허분쟁이 없기 때문에 신약 개발 프로젝트를 진행할 때 자주 사용되는 기술입니다.

 

더 짧은 제작 주기:

'Chimera' 단계를 거치지 않고, Neo를 스스로 제거하게 만들어 2세대의 번식 시간을 줄였다. 또한, TurboKnockout®은 ES 수준에서 다단계 BAC 재조합을 할 수 있어 프로젝트 주기를 크게 단축시킬 수 있습니다.

 

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● Human Antibody Discovery Using In-vivo Mouse Models

● Leveraging Humanized Mice for Human Antibody Discovery

 

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