CRISPR/Cas9과 ES Cell Targeting 중에 나에게 더 적합한 기술은 무엇일까? 어떻게 선택해야 가장 좋을까?

  최근 몇 년간 생물의약기술이 급속히 세대교체되면서 표적형 약물, 면역요법, 유전자 치료 등 특화된 치료방식이 생물 의학 혁신의 주요 방향으로 발전한 데는 유전자 편집 기술의 발전이 있었다. 1년 전의 특허분쟁에서 유전자 편집 회사인 Editas가 FDA에 의해 승인된 인간 유전자 편집의 임상 시험에 이르기까지, 우리는 유전자 편집 기술의 발전이 매우 기대되고 있음을 알 수 있다.

  현재 동물 모델 유전자 편집 기술은 크게 두 가지로 나뉜다: ES Cell Targeting 기술과 CRISPR/Cas9 기술. 유형에 따라 transgenic, knockout, knockin, humanized 및 point mutation으로 구분되며, 간단히 말하면 유전자의 덧셈, 빼기와 교체이다. CRISPR/Cas9과 ES Cell Targeting 중에 나에게 더 적합한 기술은 무엇일까? 어떻게 필요에 따라 적합한 유전자 변형 마우스를 선택해야 하는가? 아래와 같이 자세히 살펴보도록 하자.

1. 두 가지 기술의 장단점 분석

  ES Cell Targeting 기술은 마우스 배아줄기세포(ES Cell)에서 DNA 상동재조합에 의해 진행된다. ES 세포는 배반포로 재주입되어 키메라 배아를 형성하고, 이는 위임신하는 마우스 체내에서 키메라 마우스로 발달한다. 그 다음에 키메라 마우스와 wildtype 마우스의 교배를 통하여 ES 세포 중의 유전적 정보를 마우스 후대로 전달한다. ES Cell Targeting 기술은 정확하고 Off-target effect가 없으며 여러 복잡한 gene modification을 할 수 있는 장점을 가지고 있다. 반면에, 단점은 비효율적이고, 시간이 많이 소모될 뿐만 아니라 힘들고 비용이 많이 들며, 마우스에만 적용된다는 것이다. 최근 몇 년 동안 ES Cell Targeting 기술을 개량 시도 해 온 기업들이 있는데, Cyagen에서 출시한 ES Cell Targeting 기술을 기반으로 한 TurboKnockout^® Gene Targeting 기술은 제작 기간을 1년에서 반년으로 또는 심지어 CRISPR 제작 기간과 거의 동일하게 줄였으며 비용도 함께 절감시켰다.

  현재 가장 인기 있고 널리 사용되고 있는 CRISPR/Cas9 시스템은 Cas9 단백질과 가이드 RNA로 구성되어 있다. Cas9에는 아미노 말단에 있는 RuvC와 단백질 중부에 있는 HNH라는 두 개의 활성부위가 포함되어 있으며 crRNA 성숙 및 이중가닥 DNA shearing에서 역할을 함으로써 DNA double-strand break를 일으킬 수 있다. DNA가 절단된 후, 손상된 DNA와 상동성인 DNA 단편이 동시에 세포핵 내에 존재한다면, 상동성에 의해 매개된 이중 가닥 DNA 복구를 통해 표적 부위에 외부 DNA 단편을 도입하여 knockin 또는 편집할 수 있다. CRISPR/Cas9 시스템은 고효율, 빠르고 간편하며, 저렴하고 다양한 종에 사용될 수 있다는 장점이 있다. 반면에 단점은 항상 예측할 수 없고 통제 불가능한 off-target 위험이 있으며 복잡한 유전자 변형 프로젝트에는 적용되지 않는다는 것이다. 전체 게놈의 off-target 위험 연산을 통해 off-target 예측 및 어느 정도의 예방을 할 수 있음에도 불구하고, 엄밀성이 매우 높은 과학 연구를 진행할 때, 여전히 off-target 문제에 대한 답변이 필요하다.

  Cyagen은 고객들이 이미 발표한 3,600건의 논문을 분석 및 통계를 내며 Conditional Knock-Out/Knock-In 모델, 2차 타겟팅 필요한 모델, Humanized 모델, Conditional point mutation 모델과 KO-First 모델 등 복잡한 유전자 변형 프로젝트에서 이 두 가지 기술이 사용되는 비율을 비교하였다. 결과에 따르면, 복잡한 유전자 변형 프로젝트에서 TurboKnockout® 기술을 사용하는 프로젝트 수가 CRISPR/Cas9 기술을 사용하는 프로젝트 수의 6.4배가 많으며 이미 발표한 복잡한 프로젝트 관련 논문의 Impact Factor가 보편적으로 높다.

2. 어떤 기술을 지적 재산권 분쟁 걱정없이 사용할 수 있는가?

  지금도 CRISPR 특허를 둘러싼 분쟁은 계속되고 있으며 CRISPR 핵심 특허의 권리에 대한 분쟁은 여전히 결론을 내릴 수 없다. 이외에, 핵심 특허를 기반으로 수천 개의 응용특허가 확장되었다. 수천 개의 CRISPR 특허를 앞에 두고 어느 기관이나 기업도 모든 특허에 대한 라이센스를 획득하는 것은 어렵다. Broad 연구소, 미국 캘리포니아대학교, 심지어 Merck의 라이센스를 모두 획득하더라도 CRISPR 특허의 위험을 완전히 피하기는 어려우며 CRISPR 지적재산권 분쟁 문제는 후속 연구의 상업화에 악영향을 미칠 수 있다. 상업적 용도에 관여하거나 특허 분쟁에 신경 쓰는 기관의 경우, 지적 재산권 분쟁의 위험을 완전히 피하려면 ES Cell 타겟팅 기술을 선택하는 것이 여전히 가장 현명한 방법이다.

3. 어떻게 필요에 따라 적합한 유전자 변형 마우스를 선택하는가?

  CRISPR/Cas9 기술은 종에 제한이 없고 조작이 간단할 뿐만 아니라 저렴하고 제작 기간이 짧기 때문에 일반적인 Conventional Knock-Out 마우스 모델, Knock-In 마우스 모델 및 기타 종의 모델을 구축 시, CRISPR/Cas9 기술을 선택하는 것을 권장한다. 그러나 복잡한 마우스 모델 제작 프로젝트에서는, 여전히 ES Cell 타겟팅 기술을 기반으로 한 TurboKnockout^® 기술을 선택하는 것을 추천한다.

  ES Cell Targeting 기술은 복잡한 유전자 편집을 할 수 있을 뿐만 아니라 정확하고 Off-target effect가 없기 때문에 ES Cell 타겟팅 기술로 2차 타겟팅 필요한 모델, Humanized 모델, Conditional point mutation 모델과 KO-First 모델 등과 같은 복잡한 Conditional Knock-Out/Knock-In 모델을 구축할 수 있다. 또한 Cyagen에서 출시한 ES Cell 타겟팅 기술을 기반으로 한 TurboKnockout^® 기술은 특허 분쟁 문제가 전혀 없으며 고객들이 자신의 기술 혁신에 대한 지적 재산권을 완전히 보유하고 있다. 그러므로 동물 모델 지적 재산권 문제에 대한 관심이 많은 연구자의 경우, TurboKnockout^® 기술로 동물 모델을 구축하는 것을 권장한다. 예를 들면, 제약 회사들은 지적 재산권 문제를 중요시하기 때문에 약물 개발에서 사용하는 동물 모델은 보통 다 TurboKnockout^®  기술을 선택하여 제작한 것이다.

  요컨대, 이 두 가지 기술은 각자의 장단점이 있으므로 제작주기, 비용, Off-target effect 유무, 유전자 단편 크기, 조작 난이도, 종 및 지적 재산권 문제 등을 종합적으로 고려하며 가장 적합한 기술을 선택해 유전자 변형 마우스를 구축하는 것을 권장한다. 

  만약에 선택하기가 어려운 경우, 저희 기술 전문가가 상담해 드릴 수 있으니 언제든지 편하게 연락주시길 바랍니다.

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