패혈증(Sepsis)은 생명을 위협하는 전신염증반응증후군입니다. 염증과 선천 면역 간의 미묘한 균형은 병원체 침입을 방지하기 위한 보호적 면역 반응을 효과적으로 조정하는 데 매우 중요합니다. 단핵세포/대식세포가 염증과 선천 면역을 조절하는 메커니즘을 이해하는 것은 패혈증과 같은 염증성 질환에 대한 새로운 치료법 개발에 도움이 될 수 있습니다.
발로신 함유 단백질(Valosin-Containing Protein, VCP, 일명 p97)은 다양한 세포 활동과 관련된 ATPases의 (AAA+) 슈퍼패밀리의 중요한 구성원으로, 자가포식, 소포체 관련 단백질 분해(ERAD), 유전자 발현 등 여러 과정을 조절하여 세포 항상성을 유지합니다. 40개 이상의 cofactor가 p97과 상호작용을 통해 기질 모집(substrate recruitment)을 촉진함으로써 기능 조절에 참여합니다. UBXN6(UBX domain-containing protein)은 새롭게 발견된 p97 cofactor지만, 선천 면역에서 하는 역할은 아직 잘 알려지지 않았습니다.
최근 한국 충남대학교와 전남대학교 연구진은 UBXN6와 패혈증의 연관성에 대해 심층적인 연구를 진행했습니다. 연구진은 패혈증 발병 시 UBXN6가 자가포식을 활성화하고 염증을 조절하여 면역계의 억제 기능을 유도한다는 사실을 발견하고 입증했습니다. 이 연구 결과는 2024년 10월 23일 《Cellular & Molecular Immunology》 저널에 게재되었으며, 패혈증에 대한 새로운 치료법 개발에 도움이 될 것으로 기대됩니다.
연구 자료 및 면구 방법
상기 연구에서 연구진은 벌크 RNA 시퀀싱(Bulk RNA-seq)과 단일 세포 RNA 시퀀싱(scRNA-seq)을 사용하여 패혈증 환자와 대조군의 혈액 샘플을 분석했습니다. UBXN6의 기능을 탐구하기 위해 연구진은 Ubxn6flox/flox 마우스(Cyagen에서 제공)와 Lyz2Cre 마우스를 교배하여 골수 특이적 UBXN6 결핍(cKO) 마우스를 만들고, cWT 및 cKO 마우스의 골수 유래 대식세포(BMDM)를 부석했습니다. 또한 비표적 대사체학 분석을 통해 cWT와 cKO 마우스의 골수 유래 대식세포(BMDM) 간의 대사적 차이를 조사했습니다.
연구 기술 소개
연구 결과
1. 패혈증 환자에서 UBXN6 수치 상승
패혈증 환자의 유전자 발현 변화를 연구하기 위해, 연구진은 먼저 딥 RNA 시퀀싱 기술을 사용하여 나쁜 예후가 예상된 환자(SP), 회복된 환자(SR), 건강한 대조군(HC)의 말초혈액단핵세포(PBMC)에 대해 전사체 분석을 진행하였습니다. 각 그룹 간의 차등 발현 유전자(Differentially expressed gene, DEG)를 비교한 결과, 나쁜 예후가 예상된 환자(SP)에서 발현이 감소한 DEG가 주로 면역 체계와 관련된 생물학적 과정에 집중되어 있어 이들 환자가 면역 억제 특징을 보인다는 것을 발견했습니다.
자세한 분석을 통해 자가포식 관련 유전자들의 발현 프로필(GEPs)을 살펴본 결과, UBXN6, FBXO7 등 유전자의 발현이 회복된 환자(SR)와 나쁜 예후가 예상된 환자(SP) 간에 유의미한 차이를 보였습니다. 후속 분석에서는 염증성 Cytokine 관련 신호 경로의 조절과 관련이 있는 UBXN6에 초점을 맞췄습니다. 연구 결과, UBXN6 수치는 인간 패혈증 환자에서 상승되며, 그 발현 수준은 염증 유전자들의 발현과 음의 상관관계를 보였으나, FOXO3 등 자가포식 관련 유전자들의 발현과는 양의 상관관계를 나타냈습니다.
2. UBXN6, 염증 반응의 핵심 조절 인자
UBXN6를 발현하는 세포의 유형을 더 깊이 이해하기 위해, 연구진은 먼저 단일 세포 RNA 시퀀싱(scRNA-seq) 실험을 수행했습니다. 그 결과 UBXN6는 주로 단핵세포/대식세포에서 발현되며 T세포나 B세포에서는 발현되지 않는다는 것을 발견했습니다(그림 1). 그래서 연구진은 Ubxn6flox/flox 마우스(Cyagen에서 제공)와 Lyz2Cre 마우스를 교배하여 골수 특이적 UBXN6 결핍(cKO) 마우스를 만들었습니다.
그 후, 연구진은 LPS(지질다당류)를 사용하여 마우스에 골수 유래 대식세포(BMDM)를 자극하고 벌크 RNA 시퀀싱(Bulk RNA-seq) 분석을 수행했습니다. 히트맵 분석 결과, cKO 골수 유래 대식세포(BMDM)에서 Tnf와 Il18을 비롯한 여러 염증성 Cytokine과 Ccl3, Ccl4, Ccl5를 비롯한 Chemokine의 발현 수준이 cWT 골수 유래 대식세포(BMDM)에 비해 더 높은 것으로 나타났습니다(그림 1). 또한 UBXN6의 결실은 NLRP3 인플라마좀(inflammasome)의 활성화를 조절했습니다. 이 결과는 UBXN6이 다양한 선천 면역 신호 경로에 의해 유발된 염증 반응을 조절하는 데 중요한 역할을 한다는 것을 나타냅니다.
그림 1. UBXN6의 골수성 발현은 LPS에 의한 전염증 반응을 제어한다. [1]
3. 자가포식 유도 및 소포체 관련 단백질 분해(ERAD)에 핵심적인 역할을 하는 UBXN6
다음으로 연구진은 자가포식에서 UBXN6의 역할을 분석했습니다. 다양한 자가포식 자극에 노출된 상황에서 cKO 골수 유래 대식세포(BMDM)와 shUBXN6-transduced 1차 인간 단핵구에서 LC3 puncta가 현저히 감소한 것으로 나타났습니다. 또한, LPS 자극을 진행한 후 cKO 골수 유래 대식세포(BMDM)에서 관찰된 오토파고솜(Autophagosome)의 수는 cWT 골수 유래 대식세포(BMDM)에 비해 상당히 낮았습니다. 자가포식 억제제 Baf-A1로 처리한 후, cKO 골수 유래 대식세포(BMDM)의 LC3-II/ACTB 비율이 현저히 감소하며 자가포식 유도가 차단되었음을 나타냈습니다. 이러한 데이터는 UBXN6가 자가포식 유도에서 중요한 역할을 한다는 것을 시사합니다.
연구진은 UBXN6가 소포체 관련 단백질 분해(ERAD) 경로를 조절하는지 확인하기 위해, LPS와 SMER28에 반응하는 cWT와 cKO 골수 유래 대식세포(BMDM)에서 ERAD 관련 유전자(Sel1l, Edem1, Syvn1 등)를 분석했습니다. cKO 골수 유래 대식세포(BMDM)에서 모든 유전자의 발현 수준은 cWT 골수 유래 대식세포(BMDM)에 비해 유의미하게 감소했습니다. 또한, 지질다당류(LPS) 자극을 진행한 후 cKO 골수 유래 대식세포(BMDM)에서 SEL1L 및 SYVN1 단백질 수준도 현저히 감소했습니다. 이는 UBXN6가 선천 면역을 자극한 후 소포체 관련 단백질 분해(ERAD)의 활성화에 중요한 역할을 하다는 것을 보여줍니다.
자가포식 및 소포체 관련 단백질 분해(ERAD)의 결함은 미토콘드리아(mitochondria) 기능 장애와 관련이 있으며, 이는 mtROS의 축적으로 이어집니다. 따라서 연구진은 cWT와 cKO 골수 유래 대식세포(BMDM)의 mtROS 수준을 추가로 조사했습니다. cWT 세포와 비교하면, cKO 골수 유래 대식세포(BMDM)에서 UBXN6의 결실은 지질다당류(LPS) 유도에 의한 mtROS 생성이 현저히 증가했습니다. mtROS 억제제 MitoTEMPO로 처리한 후, cWT와 cKO 골수 유래 대식세포(BMDM)에서 염증성 Cytokine과 Chemokine의 발현 수준은 유의하게 감소했습니다. 이러한 결과는 골수성 UBXN6가 미토콘드리아(mitochondria) 산화 스트레스를 조절하여 자가포식 유도 및 소포체 관련 단백질 분해(ERAD)에 핵심적인 역할을 한다는 것을 시사합니다.
4. UBXN6 결핍은 면역 대사 리모델링을 유도합니다.
UBXN6가 염증 중 면역 대사에 영향을 미치는지 알아보기 위해 연구진은 비표적 대사체학 분석을 통해 cWT와 cKO 골수 유래 대식세포(BMDM) 간의 대사적 차이를 조사했습니다. UBXN6의 결핍은 젖산/피루브산 비율을 현저하게 증가시켰습니다. LPS 자극에 반응하여 cKO 골수 유래 대식세포(BMDM)의 세포 ECAR(extracellular acidification rate)이 크게 증가했으며, 유산소성 해당작용의 핵심 유전자인 Hif1a 및 Ldha를 코딩하는 mRNA 수준도 증가했습니다(그림 2). 따라서 대식세포에 UBXN6가 없으면 면역 대사가 유산소성 해당작용으로 전환된다는 것을 알 수 있습니다.
비표적 대사체학 분석에서는 처리하지 않은 조건에서 cKO 골수 유래 대식세포(BMDM)의 분지쇄 아미노산(BCAA) 수준이 현저히 증가한 것을 발견했습니다(류신, 이소류신, 발린 포함). 흥미롭게도 LPS 자극 진행 전후의 모든 시점에서 cKO 골수 유래 대식세포(BMDM)의 분지쇄 아미노산(BCAA) 농도가 유의미하게 증가했습니다(그림 2). 후속 분석에 따르면, 골수성 UBXN6의 결실은 L형 아미노산 수송 단백질의 발현 불균형을 통해 유산소 해당작용과 분지쇄 아미노산(BCAA)의 축적을 유도할 수 있음을 시사합니다.
그림 2. UBXN6 결핍형 대식세포에서 필수 아미노산 수준 증가하고 유산소 해당작용이 강화한다 [1]
이전 연구에 따르면 세포 내 분지쇄 아미노산(BCAA) 수치가 높아지면 mTOR 복합체 1(mTORC1)이 활성화되어 염증 반응을 촉진하는 것으로 나타났습니다. 그래서 연구진은 AMPK와 mTOR 신호 경로의 활성화 상태를 분석했습니다. 그 결과, 지질다당류(LPS) 자극을 받은 cKO 골수 유래 대식세포(BMDM)에서 인산화 mTOR 키나제(kinase)와 리보솜 단백질 S6 키나아제 1의 수치가 유의미하게 증가했습니다.
그리고 LPS 처리 후에는 cKO 골수 유래 대식세포(BMDM)에서 리소좀 재생 및 생성 조절 인자인 전사인자 TFEB의 핵 전위(nuclear translocation)와 다운스트림 자가포식 유전자의 발현이 현저하게 감소하는 것을 발견했습니다. 이러한 연구 결과는 UBXN6가 mTOR-TFEB 신호 경로를 활성화함으로써 리소좀 생성을 촉진한다는 것을 시사합니다.
5. 생체 내 염증 조절에 필수적인 UBXN6
UBXN6가 생체 내 염증을 조절하는지 확인하기 위해 연구진은 cWT 마우스와 cKO 마우스에 LPS 자극을 실시했습니다. cWT 마우스에 비해 cKO 마우스는 LPS에 의한 사망률에 더 높은 감수성을 보였습니다(그림 3). 이는 골수성 UBXN6 결핍으로 인한 심각한 염증이 치명적인 결과를 초래한다는 것을 시사합니다.
cWT 마우스에 비해 cKO 마우스의 폐와 비장에서 더 많은 염증 반응을 보였습니다(그림 3). cKO 마우스는 급성 폐 손상 이후 폐 조직에서 부은 미토콘드리아(mitochondria)의 비율이 현저히 높았습니다. 이러한 결과는 선천 면역 세포의 UBXN6가 염증 반응을 조절하는 데 중요하다는 것을 시사합니다.
그림 3. UBXN6는 패혈증으로 유발된 사망율과 전신 면역 반응을 완화한다 [1]
연구 결론
전반적으로 이 연구는 골수성 UBXN6가 자가포식, 소포체 관련 단백질 분해(ERAD) 및 면역 대사를 조율하는 데 중요한 역할을 하여 대식세포의 미토콘드리아(mitochondria) 항상성과 염증에 영향을 미친다는 사실을 처음으로 확인했습니다.
또한 상기 연구 결과는 패혈증 발병 시 면역 억제를 위한 UBXN6의 중요성을 강조하며, UBXN6를 타겟으로 하는 새로운 치료법이 전신 염증을 가진 환자에게 잠재적인 치료 효과를 제공할 수 있음을 시사합니다.
참고 문헌：
[1]Kim, Y.J., Lee, SG., Park, S.Y. et al. Ubiquitin regulatory X (UBX) domain-containing protein 6 is essential for autophagy induction and inflammation control in macrophages. Cell Mol Immunol (2024). https://doi.org/10.1038/s41423-024-01222-1
Cyagen의 Ubxn6 마우스 모델 제작 서비스
Cyagen은 Ubxn6 Knockout(KO) 마우스 모델과 cKO 마우스 모델을 제공하며 빠른 납품이 가능합니다. Cyagen의 연구 모델 제작 서비스를 통해 짧은 시간에 보다 비용 효율적인 실험용 마우스 모델을 확보하고 연구를 가속화할 수 있습니다!
-Strain Name: C57BL/6JCya-Ubxn6em1/Cya
-Strain Number: KOCMP-66530-Ubxn6-B6J-VA
-Catalog Number: S-KO-11769
-응용 분야: 세포생물학, 사망, 신진대사 등
-타겟팅 방법:
-Strain Name: C57BL/6JCya-Ubxn6em1flox/Cya
-Strain Number: CKOCMP-66530-Ubxn6-B6J-VA
-Catalog Number: S-CKO-13145
-응용 분야: 세포생물학, 사망, 신진대사 등
-타겟팅 방법:
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