녹아웃(KO) 마우스 | Cyagen Korea

 

현재와 미래에 있어서 전 세계의 가장 중요한 사회적 문제 중 하나가 바로 고령화이다. 인간의 수명이 길어지고 선진경제국의 출산율이 계속 낮아져 전 세계 65세 이상 인구가 2050년에는 21억 명, 2100년에는 31억 명에 달할 것으로 전망됐다.

 

고령화는 일면으로는 노동력의 상실을 초래하고 다른 일면으로는 사회 의료비 급등을 초래한다. 이와 같은 현상을 초래하는 원인은 발병률이 높은 노인 질환과 크게 연관된다. 신경퇴행성 질환이란 연령 증가에 따라 발병률이 대폭 증가하는 병을 말한다. 현재 모든 신경퇴행성 질환에 특효약이나 치료방안이 없으며 병의 진행을 늦추는 약도 아주 드물다. 다만 좋은 생활습성을 통해 발병률을 낮추고, 발병 시기를 늦추는 방법밖에 없다.

 

신경퇴행성 질환 환자는 사망 후 부검에서 거의 모두 뇌 위축 현상을 발견할 수 있는데, 이는 신경원의 사망과 수상돌기와 축삭돌기 감소와 밀접한 관계가 있다. 현재 수많은 과학자와 대량의 연구 경비가 이러한 질병에 대한 연구 및 약물 개발에 투입되고 있다. Cyagen은 바이오 분야에 다년간 종사하여 신경질환, 특히 신경퇴행성 질환에 관한 연구에 풍부한 경험을 축적했다. 본문은 과학연구 입장에서 흔히 볼 수 있는 신경퇴행성 질환의 고전적 연구방법을 소개하는 데 그 취지가 있으며 이와 같은 전형적 연구방법을 바탕으로 고객에게 더욱 편리한 원스톱 서비스를 제공하고자 한다.

 

 

   

그림 1. 고령화 및 신경퇴행성 질환의 주요 특징

 

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비록 신경퇴행성 질환이 말기로 넘어가면 전체 중추신경계에 손상을 주고 환자를 사망에 이르게 할 수 있으나 단, 발병 과정에서 이들의 초기 공격 목표는 각기 다르다.

 

(1) 알츠하이머병(Alzheimer Disease, AD)의 초기 주요 병소는 일반적으로 해마와 전두측두엽 부위에서의 피라미드 뉴런에 있고 기억력 감퇴로 나타나며 최근에 일어난 일을 잘 잊어먹고 집중력이 떨어지며 심지어 몇 분 전의 대화내용까지 잊어버리게 된다.

(2) 파킨슨병(Parkinson Disease, PD)은 중뇌 흑질 영역에서 도파민을 분비하는 뉴런이 손상되어 투사 영역(주로 선조체)의 운동억제 기능이 상실되면서 환자의 비자발적 떨림이 발생하고 운동통제 능력이 약화된다.

(3) 근위축성 측삭경화증(Amyotrophic Lateral Sclerosis, ALS)은 운동피질이나 주변 운동신경을 손상시켜 대부분 환자가 진단을 받은 후 곧 운동능력을 거의 상실하게 되고 심지어 호흡에 영향을 주어 사망에 이르게 한다.

(4) 헌팅턴병(Huntington Disease, HD) 환자는 선조체에 신경원이 죽어 자신의 행동과 정서에 대한 통제력이 약해지고 인지와 운동기능에 심각한 손상을 입게 된다.

(5) 전두엽치매(Frontotemporal Dementia, FTD)와 루이소체 치매(Dementia with Lewy bodies, LBD)는 인지 기억력 손상이 위주이며 프라이온 질병(Prion Diseases)은 단백질의 변화를 내인으로 하는 신경 병변이다.

(6) 다발성 경화는 축삭 외부 미엘린초 조직을 대상으로 하며 미엘린초가 자가면역체계의 공격을 받고 신경 전기신호의 전달을 늦추거나 약화시켜 환자의 운동 내지 호흡에 영향을 준다.

 

Cyagen | Fig. 2. Brief description of lesions and pathology of major neurodegenerative diseases

그림 2. 주요 신경퇴행성 질환의 병소 및 병리 약술

 

주요 신경 퇴행성 질환의 발병율

그림 2에 표시된 질병에서 AD의 발병률이 가장 높아 10만명 당 약 1200명 꼴로 해당 질환을 앓고 있으며 이를 65세 이상 노인에 한할 경우 유병률은 10%가 넘게 된다. 유병률 2위는 PD이며 전체 연령대에서 약 0.3%의 발병률을 보였다. 다음은 환자 비중은 많지 않으나 절대 무시할 수 없는 FTD, HD, ALS이다.  HD와 FTD의 발병에는 뚜렷한 성별 차이가 없으며 그중에 HD는 유일한 병원성 유전자를 명확히 한 질병에 속한다. PD와 ALS는 남성이 걸리기 쉬운 질환이며 또한 남성 환자 수가 거의 여성 환자 수의 2배이며 AD는 이와 반대로 여성 환자의 수가 남성의 약 1.4배이다. 유전적 입장에서 볼 때 HD 질환이 100% 우성 유전적 질환인 것을 제외하고 AD와 PD 등 흔한 신경퇴행성 질환은 주로 특발성 질병이다.

  

Cyagen | Fig. 3. Epidemiological characteristics of neurodegenerative diseases

그림3. 신경퇴행성 질환의 역학적 특징

 

1. 흔한 신경 퇴행성 질환 및 모델

그 어떤 질병의 연구에는 동물 모델이 반드시 필요하고 신경퇴행성 질환 역시 예외가 아니다. 따라서 이와 같은 연구를 진행하기 위한 첫걸음은 바로 적합한 동물모델을 선택하거나 제작해야 한다. 현재 랫드와 마우스를 대표로 하는 설치류 동물모델은 신경퇴행성 질환을 연구하는 주력이며 서로 다른 질병마다 상이한 그 병리적 특징으로 인해 겨냥하는 타겟 유전자가 다르게 된다. 다음은 몇가지 주요한 신경퇴행성 질환 모델이다.

 

AD: 대부분의 AD모델은 Aβ 전구체 및 절단효소(PS1/2)와 tau에 대한 유전자 편집으로 만들어진다. 이 밖에 2종 독성 단백질을 브레인 맵핑 주사하여 급성으로 모델을 제작하는 경우도 있다. 또한 APOE는 비록 AD와 연관되어 있으나 그 자체로는 AD모델이 될 수 없으며, 기존의 AD모델과의 outbreeding을 통해 연구해야 한다. BACE1도 Aβ 형성에 관여하고 있으나 현재 인체에서 관련 돌연변이로 Ad를 초래한 보도는 없다. 다른 일부는 TREM2를 대표로 하는 면역 관련 유전자이나 APOE와 마찬가지로 이러한 유전자가 편집된 동물은 아직 AD의 단독 동물 모델로 할 수 없다.

 

PD: PD에 있어서 α-Synuclein은 신경원 내 루이소체를 구성하는 주요 성분이며 자연히 PD 동물모델을 제작하는 주요 유전자이 되었다. 그러나 AD연구에서 APP와 그 절단효소 유전자가 지배적 위치를 차지하는 것과 달리 가족성 PD 연구에서는 PINK1, Parkin, LRK2와 DJ-1 등 유전자가 차지하는 비중도 매우 크며, 이와 같은 유전자는 대부분 α-Synuclein의 응집을 억제하고 그 분해를 촉진하는 과정에서 작용한다. 단, 총체적으로 PD 유전자 편집의 모델 표현형은 AD 질환 표현형에 비해 뚜렷하지 않아 자주 MPTP, Roteona, 6-OHDA 등 약물에 사용되어 PD 모델을 만든다.

 

HD: HD는 모델을 만들기 가장 간단한 질환이며 이 질환은 Htt단백 중 CAG의 과다 반복으로 초래되기 때문에 모델은 모두 Htt 유전자를 대상으로 한다. 다만 유전자 편집 방법과 CAG 반복 수량에 차이가 있다.

 

ALS: 루게릭병에 연관된 유전자는 비교적 많고 잡다하다. 어떤 것은 상염색체에 위치하고 어떤 것은 성염색체에 위치한다. 우성으로 유발하기도 하고, 또 열성으로 유발하기도 한다. 따라서 모델도 각양각색이며 그 중에 가장 일찍 발견된 모델이 SOD1이다. 단 최근 10여 년 간 비교적 많이 연구된 것은 단백질 응집체를 형성하는 TDP-43 및 산발성 ALS에서 가장 흔히 보이는 C9ORF72이다.

 

FTD: 이 질병은 AD와 마찬가지로 tau 응집이 있고, 또 ALS의 특징인 단백질 TDP-43과 연관이 있으나, ALS와 가장 인연이 깊어, 많은 단백질의 돌연변이는 ALS의 유인인 동시에 FTD를 유발할 수도 있다. 흥미로운 점은 이 두 질병 중 하나는 운동능력 손상 위주이고, 다른 하나는 인지능력 손상이라는 점이다.

   

Cyagen | Fig. 4. Major pathogenic genes of neurodegenerative diseases and corresponding models

그림 4. 흔한 신경퇴행성 질환의 주요 병원성 유전자 및 모델

 

2. 유전자 편집 및 질환모델 동물

윤리적 문제로 인해 신경 퇴행성 질환은 인체를 통해 조직 샘플을 채취해 연구를 진행하기가 어려운 상황이다. 따라서 마카크, 마모셋, 랫드, 마우스, 얼룩말, 초파리, 선충 등을 포함한 동물 모델이 개발되었다. 비록 영장류가 인간에 가장 가까워 이론적으로는 의약 연구 모델로 가장 이상적이지만, 원가가 높고 실험 주기가 길어 유전자 편집이 어렵다. 제브라피시와 초파리는 대량 신속처리 연구에 적합하다. 번식 속도가 빠르고 실험 원가가 비교적 저렴하나 그 신경계가 너무 간단해 많은 인지 기능 관련 표현형 연구를 진행할 수 없다. 종합하여 볼 때 설치류 동물은 인간과 유전자적으로 90% 이상의 유사성이 있고, 영장류에 비해 실험주기가 크게 낮으며, 인간의 인지과정을 거의 재현할 수 있는 데다 이미 많은 연구 데이터가 축적되어 있어 또 상대적으로 원가가 저렴해 현재 가장 이상적인 동물 모델이다.

 

각종 핵산효소기술이 2009~2013년 사이 폭발적으로 발전했고 그 이후 꾸준히 보완되었으며, 특히 CRISPR/Cas9 기술의 발명은 유전자 편집의 효율을 대폭 향상시켰고 난이도와 원가도 현저히 낮아져 신경퇴행성 질환의 연구에서 중요한 역할을 하고 있다. 유전자 편집에서 유전자 변형이 먼저 나타났고 동시에 현재 가장 많은 질환 모델을 가지고 있는 유전자 조작 방식이긴 하나 유전자 복제 수가 불확실하고 삽입 위치가 불확실하며 과발현만 가능한 등 단점이 있다. 따라서 유전자 발현이 더 잘 통제하고 동시에 무작위 삽입에도 다른 유전자의 발현에 영향을 주지 않기 위해 이 방법도 점차 다른 방법에 의해 대체되고 있다.

 

유전자 발현을 증가시키는 유전자 변형 과발현과는 반대로 가끔 유전자의 발현을 낮추거나 제거해야 할 필요가 있어 유전자 녹아웃 기술이 탄생했다. 이 방법은 전체 유전자나 엑손의 직접적인 제거나 프레임시프트 변이를 통해 이 유전자 산물이 전사 가능한 활성을 철저히 상실케 하거나 기능을 온전히 상실케 한다. 보도에 의하면 마우스의 30% 유전자는 온전한 제거를 통해 치사되었다고 한다. 따라서 한편으로는 배아 치사를 회피하고 다른 한편으로는 더욱 세밀한 연구를 위해 Cre-LoxP 방법이 탄생했다. 이 방법은 Cre 앞에 연결된 프로모터에 의해 Cre 절단 효소의 발현 시간과 발현 부위를 결정할 수 있으며, 제거된 타겟 유전자 양쪽에 loxp locus 만 연결하면 된다.

 

Cre-LoxP 기법을 약간 개선하여 유전자 녹인을 진행할 수도 있다. 한편으로는 양 끝에 LoxP가 달린 종결 서열과 외래 유전자의 조각을 마우스 게놈에 삽입하고, 이러한 마우스는 Cre-LoxP와 outbreeding하고 외래 유전자의 종결 서열을 제거한 후에만 발현할 수 있다.

 

보상이나 인트론의 작용으로 인해 하나 또는 몇 개의 유전자가 변형되어 뚜렷한 표현형을 생성할 수 없을 시 더 큰 염색체에 대해 제거나 복제 등 조작을 진행할 수도 있으며, 이러한 변화는 많은 유전적 질환에서도 자주 발생한다.

 

동물을 연구하는 목적은 인체에 응용하기 위함이다. 따라서 상기와 같은 유전자 편집방식을 바탕으로 키메라 마우스가 생성되었다. 이 마우스에서는 서로 다른 마우스의 세포가 동시 존재할 수 있고 또 사람과 마우스의 세포가 동시 존재할 수 있다. 단, 사람의 세포 투입은 윤리적인 문제가 존재한다.

 

현재 가장 유행하고 있는 모델 제작 방법은 인간화이며 이 방식은 인간의 유전자를 마우스에 정위치 도입을 통해 필요에 따라 기존 유전자를 대체하거나 대체하지 않음, 인트론 휴대 여부, 단일 유전자 또는 큰 염색체 조각 등을 선택할 수 있다.

  

Cyagen | Fig. 5. Common types of gene editing mice of neurodegeneration

그림 5. 신경 영역에서 흔히 볼 수 있는 유전자 편집 마우스 종류

 

연구가 진행될수록 많은 전통적인 유전자 변형 모델들이 과학 연구의 혁신적인 요구를 만족시키지 못해 새로운 유전자와 신경 퇴행성 질환의 관계 연구 및 질환에 대한 정확한(시간 및 공간) 치료제의 치료 작용에 대한 연구는 약물 처리나 바이러스 주사와 연관되지 않을 수 없다. 많은 과학 연구자들의 시간을 절약하기 위해서, Cyagen 신경 과학 원스톱 솔루션은 유전자 편집 모델과 질환 모델의 교차 번식, 플라스미드 구축, 바이러스 패키징, 신경 줄기세포 유전자 편집, 외래 바이러스 약물의 뇌 입체 맵핑 주사, 조직병리 형광 이미징 및 무균 마우스 뇌 장축 등 기술을 통해 조력하고자 한다. 원스톱 서비스를 누리는 동시에 실험기술 학습이 아닌 과학문제 해결에 주의력을 몰두하게 한다.

 

3. 마우스-인간 신경퇴행성 질환의 연령 관계

신경퇴행성 질환은 자폐증, 정신분열증 등 사춘기 또는 갓 성인이 된 직후에 발병하는 정신적 질환에 비해 발병 시기가 늦어 대부분의 환자가 50세 이후에 발병하므로(잘 알려진 신경퇴행성 질환 중 헌팅턴병과 다발성 경화의 발병이 빠름). 상응한 실험 window period도 비교적 뒤처져 있다. 단, 현재의 유전자 편집은 이와 같은 마우스 질환 모델의 발병 시기를 앞당길 수 있기 때문에 인간의 발병 시점과의 대응 관계가 그다지 엄격하지 않아 마우스를 통한 연구 결과를 신중하게 대해야 하며 그대로 인체실험에 적용할 수 없다. 그럼에도 불구하고 동물실험은 인체실험의 바탕으로서 기여도와 역할이 매우 크다.

 

 

Cyagen | Figure 6. Mice - human age relationships in neurodegenerative diseases

그림 6. 마우스-인간 신경퇴행성 질환의 연령 관계

 

신경퇴행성 질환의 발병 시기 문제로 인해 마우스를 서로 다른 질환에 적응할 수 있는 연령까지 사육해야 실험을 시작할 수 있다. 예를 들어 파킨슨병에 대한 마우스의 실험은 대부분 10주에서 60주 사이에서 진행하고 알츠하이머병의 연구는 대부분 20주 이후에 진행한다. 유전자 변형과 유전자 편집을 거친 마우스는 유전자가 변형되었기에 번식력, 표현형이 어느 정도 영향을 받았을 수 있으므로 이 또한 번식과 사육에 새로운 조건을 요구하게 된다.

 

Cyagen 모델동물연구센터는 중국 장쑤성 타이창, 광저우, 허베이성 구안 등 지역에 총 400,00㎡에 달하는 신규 동물시설을 갖추고 있으며, 25,000㎡가 넘는 SPF급 동물실험실에 IVC 사육 설비가 1,600여 세트를 보유해 SPF급 랫드/마우스 15만 케이지 이상을 사육할 수 있고 동물 군체 규모가 50만 마리를 초과한다. 건강검진, 유전적 통제에서부터 인원 교육훈련, 맞춤형 번식 등에 이르기까지 모든 면에서 동물 사육과 번식에 대한 요구를 만족시킨다. 고객은 F1 generation 마우스를 획득 후 스스로 번식을 진행하는 것을 선택할 수 있고 Cyagen의 전문화, 고효율화 번식을 통하여 빠르게 충분한 수량의 실험용 마우스를 얻을 수도 있다. 번식 후 마우스는 Cyagen이 적당한 연령까지 대신 사육할 수 있으며 수요에 따라 마우스를 받은 후 스스로 실험을 진행하거나 Cyagen 기술 서비스 플랫폼에서 다음 단계 실험을 계속 진행할 수도 있다.

 

4. 신경과학 연구에서 가장 많이 사용하는 표현형 분석 수단

다음은 3대 신경생물학 전문지(Neuron, Nature Neuroscience, Journal of Neuroscience)의 최근 5년간 연구 논문 발표 수량을 집계한 결과이다. 모델 선택에서 랫드/마우스 및 신경줄기세포가 50% 이상을 차지했고 나머지 세포계, 비인간 영장류 등의 비중이 절반 수준에 못 미치고 있다. 그중에서도 마우스는 유전자 편집과 관련된 모델분야에서 가장 높은 비중을 차지하고 있으며, 랫드는 보다 발달하고 훈련이 용이한 특징으로 신경퇴행성 질환의 연구에서 중요한 위치를 차지하고 있다. 이밖에 랫드와 마우스를 모델로 상기 문헌과 동물모델을 응용한 연구에서 면역형광 조직화학, 행동학과 바이러스 트랜스펙션/추적 등 방법이 특히 중요하다.

 

 

Cyagen | Fig. 7. Research papers published in three important journals of neuroscience in past five years

 

그림 7. 3대 신경생물학 전문지의 최근 5년 발표 문장 분석

 

Cyagen의 성숙하고 안정적이며 혁신적인 약물 연구 개발 플랫폼은 신경과학 연구에 다양한 행동학, 면역 형광 그룹화 기술 서비스를 제공할 수 있으며, 플라스미드 바이러스 벡터 설계를 도와 특정 뇌영역 벡터 주사를 빠르게 실현하고, 추후 병리학적 검증을 결부하여 가장 빠른 시간에 소중한 데이터를 얻게 한다.

 

신경퇴행성 질환에서의 동물행동학 연구는 크게 네 개 부분 학습기억, 운동균형, 정서정신, 사회교제로 구분할 수 있다. 일반적으로 신경 퇴행성 질환은 말기에 이르러 이러한 방면에 심각한 영향을 끼치지만 서로 다른 질환에 대해 영향을 주는 주요 방향이 다르다. 다음 표는 신경 퇴행성 질환에 자주 사용되는 가장 잘 알려진 세 가지 행동학적 방법을 요약했다.

 

Cyagen | Table 1. Common behavioral experimental methods in rodents

표 1. 설치류에서 흔히 사용되는 행동학적 실험방법

 

Cyagen 소동물 표현형 분석 플랫폼은 다양한 행동학 실험 서비스를 제공한다. 고객은 Cyagen 플랫폼 시설로 자체실험(동물조작허가증과 플랫폼교육이 필요함)을 선택할 수 있으며, Cyagen 소동물 표현형 분석플랫폼 기술자에게 실험을 의뢰할 수도 있다. 현재 Cyagen이 제공하는 행동학 실험 항목은 다음과 같다.

 

  • 학습기억능력 검사: 수중 미로, Barnes 미로, 방사 미로, 새로운 물체 인식, T/Y 미로 등
  • 운동능력 검사:  Rotarod, 걸음걸이 측정기, TST 장치 등
  • 정서 검사: 오픈필드 실험, 강박 수영, 고가 미궁, 설탕물 선호도 등

 

Cyagen은 전체, 기관, 세포와 분자 수준 등 4가지 차원으로부터 동물 행동 평가체계의 표준과 방법 연구에 도움을 제공한다.

 

표적 또는 타겟 단백질이 명확된 상황에서 신경퇴행성 질환에 대한 일반적인 실험 절차는 다음과 같다.

 

1.관심 있는 유전자 편집 동물 주문제작: 이와 같은 작업은 시간과 신경이 많이 쓰이므로 통상 전문 업체에 맡길 수 있다. 만약 동물을 약효 연구에 사용하거나 표현형의 강화를 필요로 할 경우 약물 보조나 바이러스 주사로 동물을 처리해야 한다.

 

2.행동학적 실험으로 질환 표현형 또는 약물 효과 검증: 기전 실험은 조직절편을 통한 원위치 병리검사, 혹은 아폽토시스 노화 검사, 그리고 일반적인 분자와 단백질 신호 통로인자의 발현과 변형 연구를 필요로 한다.

 

3.전기생리학 실험: 전기생리학 실험도 표현형 검증의 일종이다. 현재 유전, 칼슘 영상기술의 발전만 해도 이미 전기신호의 입력과 출력기능을 일부 대체하였다. 물론 전기생리학이 중요하지 않다는 것은 아니며. 다만 부분적으로 다른 방법에 의해 대체될 수 있다는 것이다.

 

 

 

15년 간의 발전을 거쳐, Cyagen의 성숙되고 안정적인 혁신적 약물개발 플랫폼은 많은 신경과학 종사자들을 위해 각종 유전자 제거 벡터, 유전자 제거 세포 모델, 유전자 제거 랫드/마우스 모델 수천 건을 구축하였고 맞춤형 모델 제작, 벡터 패키징 주사에서 행동학 실험, 병리 표지물 검사, 그리고 발병기전 탐구에 이르기까지 원스톱 서비스를 제공하는 데 주력하고 있다. 관련 논문은 Neuron, Nature Neuroscience, Journal of Neuroscience 등 신경생물학 전문지를 통해 발표되었다.

 

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