CAR-T 세포 요법(Chimeric Antigen Receptor T-Cellimmunotherapy) 즉 키메라 항원 수용체 T 세포 면역 요법은 T 세포에 인공적으로 설계된 CAR 분자를 도입하여 T 세포에 표적 기능을 부여한 다음 이 변형된 CAR-T 세포를 환자에게 다시 주입하여 치료하는 것을 말합니다. CAR-T 세포 살상 종양 세포 메커니즘은 MHC 제한이 없으며 표적 항원을 결합하여 활성화함으로써 종양 세포를 효율적으로 살상할 수 있다. CAR은 인공적으로 변형된 수용체 분자로 특정 표적에 의해 면역 세포에 활성화되는 특이성을 부여하여 항원 신호 및 활성화를 인식하는 세포의 기능을 향상시킬 수 있다.
따라서 CAR 분자의 설계는 CAR-T 세포 요법의 핵심 연결 고리입니다. CAR-T 세포 요법은 혈액종양에서 전례 없는 성공을 거두었지만, CAR 분자 설계와 세포 기능 개선과 같은 몇 가지 과제에 직면해 있다.
CAR 분자는 세포 외 도메인(ectodomain), 교차 막 도메인(TMD, transmembrane domain) 및 세포 내 도메인의 세 가지 주요 부분으로 구성됩니다 (그림 1). 포외 도메인(ectodomain)의 항원 결합 도메인은 일반적으로 항체 소스의 단일 체인 조각 scFv 분자로, 주로 항체 (VL, Variable Region Of Light Chain) 과 (VH, Variable Region Of Heavy Chain) 및 중간 Linker 영역 연결로 구성됩니다. 그런 다음 경첩 영역(Hinge)을 통해 막횡단 도메인에 연결하여 항원 식별을 담당합니다. 막횡단 도메인의 주요 기능은 CAR 분자를 세포막에 고정(spud)하는 것이며, 이는 CAR 분자 발현의 안정성에 중요한 역할을 합니다. 세포내 도메인은 공동 자극 도메인과 신호 전달 도메인을 포함하며, 이 둘은 힘을 합쳐 T 세포의 완전한 활성화를 담당합니다.
그림 1 CAR의 분자 구조 설명도
다음은 CAR 분자의 다양한 부분을 하나씩 소개하겠습니다.
종양 항원을 표적으로 하는 scFv의 특이성과 친화도는 CAR-T 요법의 안전성과 유효성의 기초입니다. 종양 관련 항원(TAA)은 면역 요법의 주요 표적으로 종양 조직에서 고도로 발현되고 건강한 조직에서도 낮은 수준으로 발현됩니다. 이는 비종양 조직에 대한 표적 외 손상(On-target, Off-tumor)을 형성하고 때로는 생명을 위협하는 독성을 유발합니다. 따라서 CAR 분자 설계를 위한 scFv의 특이성이 중요합니다. On-target, off-tumor 부작용을 피하기 위해서는 항체 특이성 연구가 매우 중요합니다.
scFv의 친화도 특성은 CAR 분자의 기능을 근본적으로 결정하는 다중 수용체-리간드 상호작용을 설명하는 특히 중요한 항원 결합 도메인 매개변수입니다. 종양 세포에 있는 항원을 식별하고, CAR 신호 전도를 유도하고, T 세포를 활성화하기 위해서는, CAR 분자의 항원 결합 친화력이 반드시 적당해야 한다. 한편 친화력은 T 세포의 활성화와 종양세포에 대한 살상작용을 유도하기에 충분해야 하며, 한편 친화력은 항원 저표현이 있는 조직에 독성을 일으키고 과도한 활성화로 인한 자체 소모와 사망을 유발할 수 없다. 또한 CAR 분자와 표적 항원의 결합을 최적화하려면 표위 위치, 표적 세포의 리간드 밀도, 개별 리간드 결합 도메인의 친화력 등 다른 요소들을 고려해야 합니다.
대상 테이블 비트를 간단히 식별하고 결합하는 것 외에도 scFv 의 다른 특징도 CAR 기능에 영향을 줍니다. 예를 들어, VH 와 VL 두 체인 간의 상호 작용 방식 및 상호 보완 결정 영역의 상대적 위치는 CAR 분자의 대상 표위 친화력과 특이성에 영향을 줍니다. 표적 표위의 구조, 공간적 가용성 및 기능적 측면도 CAR 분자 설계에 고려해야 합니다.
마지막으로 면역원성도 고려해야 할 요소입니다. 하이브리도마 기술로 제조된 쥐 유래 모노클로날 항체(mAb)는 강력한 면역원성을 가지며 인체 면역계에서 항원으로 간주되어 면역계에 의해 매개되는 거부 반응을 유발하고 심각한 면역 질환을 유발할 수 있습니다. 따라서 scFv의 인간화는 CAR-T 세포의 안전성과 치료 가능성을 향상시키는 데 도움이 됩니다.
요약하면, scFv의 친화도, 특이성, 표적 에피토프 및 면역원성의 4가지 특성은 CAR-T 분자 설계에 중요합니다.
경첩 영역또는 간격 영역은 CAR 분자의 비항원 결합 세포 외 영역으로 구성됩니다. 경첩 영역의 기능은 항원 결합 도메인이 표적 표위에 들어갈 수 있도록 공간 장벽을 극복할 수 있는 유연성을 제공하는 것입니다. 경첩 영역의 길이와 구성의 차이는 CAR 분자의 발현, 유연성, 신호 전달 및 에피토프 인식에 영향을 미치고 궁극적으로 CAR 분자의 기능에 영향을 미칩니다. 따라서 최적의 경첩 영역 구조를 결정하기 위해 각 특정 항원 결합 도메인에 대해 맞춤화해야 합니다.
막횡단 도메인은 CAR 분자의 세포외 도메인을 세포내 도메인과 연결하여 리간드 인식 신호를 세포 내로 전달하는 역할을 합니다. 막횡단영역(transmembrane domain)은 종종 세포 외 간격 영역 또는 세포 내 신호 전도 영역의 요구 사항에 따라 변경되므로 CAR 분자를 설계할 때 이러한 요소를 고려해야 합니다.
Costimulatory domain
CAR 분자의 공동 자극 도메인은 T 세포에 두 번째 활성화 신호를 제공하는 역할을 합니다. 가장 흔한 공자극 도메인은 CD28과 4-1BB로 CD28 공자극 인자는 더 강한 급성 반응을 유도할 수 있지만 작용 지속성은 제한적입니다. 4-1BB 인자는 활성화 능력이 낮지만 장기 지속성이 높습니다.
T 세포 수용체(TCR)는 세포 내에서 CD3 이량체(dimer)와 밀접한 관련이 있습니다. 후자는 림프구 특이적 단백질 티로신 키나제(LCK)에 의해 인산화된 후 T 세포 활성화 신호를 시작하는 면역 수용체 티로신 기반 활성화 모티프(ITAM)를 운반합니다. 수년 동안 CD3ζ 체인은 표준 CAR 분자 신호 전달 도메인으로 사용되었으며 ITAM 의 수와 위치 등의 요소도 CAR 분자 설계에 대한 정보를 제공할 수 있습니다.
세포 내 도메인 설계의 차이와 세포인자와 리간드 도입의 차이에 따라 CAR 분자는 현재 5 개의 다른 세대로 나눌 수 있다 (그림 2).
그림 2 CAR 분자의 반복[1,2]
1세대 CAR
1980년대 말 Zelig Eshar 팀[3]은 항체 scFv와 CD3ζ를 단백질로 직접 융합하여 이러한 융합 단백질을 발현하는 T 세포가 신호를 전달하고 인터루킨을 분비하며 체외에서 특정 항원을 발현하는 림프종 세포를 죽일 수 있음을 입증하여 1세대 CAR-T가 생성되었습니다. 공동 자극 도메인이 없기 때문에 1세대 CAR-T는 신호 전달 효율이 낮고 생체 내 증식 능력이 약하고 생존 시간이 짧아 결국 임상 적용에서 기대한 효과를 얻지 못했습니다.
과학자들은 1세대 CAR-T를 기반으로 공동 자극 도메인(CD28 또는 4-1BB)을 도입하여 활성화 신호에 대한 T 세포의 반응성을 향상시키고 임상 치료에서 놀라운 치료 효과를 보여주었습니다. 현재 시판되고 있는 CAR-T 약물은 모두 Kymriah, Yescarta 등 2세대 제품입니다.
3세대 CAR-T는 더 나은 신호 전달 효과를 기대하기 위해 2세대 기반으로 2개의 공동 자극 도메인(CD28 및 4-1BB)을 도입했습니다. 그러나 공동 자극 신호는 단순한 추가가 아니며 여러 공동 자극 인자를 증가시키면 CAR-T 세포 내 세그먼트 도메인의 길이가 변경되어 원래 신호가 약해지거나 전달되지 않을 수도 있습니다. 따라서 이 방법이 제공하는 임상적 이점은 여전히 논란의 여지가 있습니다.
CAR-T 세포의 기능을 향상시키기 위해 4세대 CAR-T는 세포 내 도메인을 도입하여 일부 소분자 물질(예: 염증성 사이토카인 IL-12)을 공동 발현하여 사이토카인에 의해 유도된 신호를 유발하거나 CAR-T 세포의 기능에 영향을 미치는 일부 신호 경로를 차단하여 더 강력한 치료 효과를 얻을 수 있습니다.
5세대 CAR-T, 즉 범용 CAR-T는 건강한 지원자로부터 T세포를 획득하고 유전자 편집 및 녹아웃하여 CAR 유전자로 만든 CAR-T세포를 말하며, 가장 큰 장점은 환자로부터 T세포를 얻어 맞춤화할 필요가 없고 현물 공급을 할 수 있어 시간과 치료 비용을 절약할 수 있다는 점이다.
CAR 분자 구조의 각 모듈은 독립적이고 협동적으로 CAR-T 세포의 기능에 영향을 미칩니다. 일반적으로 scFv 와 공 자극 분자 방면에서 개조를 시도하는 것은 CAR 분자 설계와 최적화의 접점이다. 위에서 언급한 5세대 CAR 외에도 항원 손실을 위한 2가 직렬 CAR, 건강한 조직을 특이적으로 식별하는 억제 CAR, 자살 유전자를 운반하여 안전성을 향상시키는 CAR 등과 같은 다른 목적을 기반으로 하는 다른 새로운 CAR 분자도 설계되었습니다. 그러나 일부 연구에서는 경첩 영역과 막횡단 도메인이 CAR 분자 설계의 중요한 잠재적 구성 요소일 수 있으며 CAR 기반 항종양 기능을 개선하는 데 필수적이라는 것을 보여주었습니다. CAR 분자의 설계 단계에는 여러 구성 요소가 포함되기 때문에 CAR 최적화 프로세스를 테스트하기가 어렵기 때문에 차세대 CAR-T 세포의 합리적인 설계를 위해 체계적인 평가와 고려를 수행해야 합니다.
[1] Mchayleh, W.; Bedi, P.; Sehgal, R.; Solh, M. Chimeric Antigen Receptor T-Cells: The Future Is Now. J. Clin. Med. 2019, 8, 207. https://doi.org/10.3390/jcm802020
[2] Hughes-Parry Hannah E., Cross Ryan S., Jenkins Misty R.(2019). The Evolving Protein Engineering in the Design of Chimeric Antigen Receptor T Cells. Int J Mol Sci, 21(1), undefined. doi:10.3390/ijms21010204
[3] Eshhar, Z., Waks, T., Gross, G. and Schindler, D. G., Specific activation and targeting of cytotoxic lymphocytes through chimeric single chains consisting of antibody-binding domains and the gamma or zeta subunits of the immunoglobulin and T-cell receptors. Proc Natl Acad Sci USA 1993. 90: 720–724.
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