현재 키메라 항원 수용체 T 세포 면역 요법(Chimeric Antigen Receptor T-Cell Immunotherapy, CAR-T)은 혈액 종양 치료 분야에서 괄목할 만한 결과를 얻었습니다. 그러나 저분자 또는 항체 약물과 달리 CAR-T는 효능에 영향을 미칠 수 있는 많은 요인이 있는 '살아있는' 세포 약물이며 그 중 CAR 분자 구조가 핵심 요소입니다.
CAR 분자 구조는 종양 항원을 인식하는 항체 단일 가닥 가변 영역, 경첩 영역(hinge region), 세포 내 공동 자극 도메인 및 신호 전달 도메인을 포함합니다. 설계의 합리성은 CAR-T 세포의 사멸 효과, 생체 내 지속성 및 안전성에 영향을 미칩니다. 따라서 다양한 종양 치료 표적에 대해 합리적이고 효과적인 CAR 분자를 설계하고 후속 CAR-T 세포 구축을 위해 CAR 렌티바이러스로 패키징해야 합니다.
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먼저 몇 가지 실험 사례를 보자
CD19 항원을 발현하는 렌티바이러스 정제액을 구배 희석(0.01, 0.1, 1, 10μl)하고 동일한 수의 293T 세포에 첨가하고 72시간 후 293T 세포의 양성률을 유속으로 검출하였다. 그런 다음 공식에 따라 렌티바이러스의 형질도입 역가를 계산합니다.
A: 0.1μl 군의 양성 세포 비율을 나타낸다
B: 0.01μl 조의 양성 세포 비율
N: 바이러스를 추가 할 때 세포 수
V：A조에 추가된 바이러스 볼륨
그림 1. CD19 항원 렌티바이러스 역가 검출 결과
(데이터 출처: Cyagen)
그림과 같이 CD19 항원 양성 세포의 수는 바이러스 증가에 따라 점차 증가하고 있다. 렌티바이러스가 좋은 감염 활성을 가지며 위의 공식에 따라 계산된 바이러스 역가는 1.4×108 Tu/ml입니다.
성공적으로 제조된 상기 CD19 바이러스를 293T 세포로 형질감염시키고, 다중 스크리닝 후 양성률이 거의 100%인 CD19-293T 세포를 얻었으며, 양성률 테스트 결과는 아래 그림에 나와 있습니다.
그림 2 CD19-293T 안정 발현 세포주 양성률 검사 결과
(데이터 출처: Cyagen)
CD19 표적을 위해 설계된 2 세대 클래식 CAR 분자를 렌티 바이러스 벡터에 구축하고 CD19-CAR 렌티 바이러스를 패키징했습니다. 위의 방법으로 바이러스 역가를 검출하였으며, 계산 후 얻은 바이러스 역가는 4.33×108 Tu/ml이다.
그림 3 CD19 CAR 분자 구조, 여기서 VH 및 VL 서열은 CD19 항체 FMC63 클론에서 파생된다
그림 4 CD19 CAR 렌티바이러스 역가 검출 결과
(데이터 출처: Cyagen)
그림 5. 다른 세포 렌티바이러스 감염 효과도
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