녹아웃(KO) 마우스 | Cyagen Korea

유전자 치료 과녁 발견과 약물 개발 과정에서 어떻게 유전자 조각을 목적지 조직 기관에 효율적이고 정확하게 전달하며 기체 면역, 탈과효과 등의 부작용을 일으키지 않는 것은 현재 공략해야 할 큰 기술적 난점이다. 과학 연구원이 대량의 연구를 전개한 후에, 두 가지 종류의 배달 시스템을 형성하였다. 바이러스 벡터와 비바이러스 벡터다. 그 중에서도 rAAV 바이러스는 성질이 강하고, 숙주 범위가 넓으며, 장기적으로 외인성 유전자(exogenous gene)를 안정적으로 표현하고, 안전성이 높고, 물리적 성질이 안정적이라는 장점이 있다. 이 때문에 rAAV는 체내 유전자 조작 실험에 많이 쓰인다.

rAAV 를 운송 시스템으로 사용하여 성공적인 체내 유전자 조작 실험을 하는 것은 쉽지 않다. rAAV 혈청형 선택, 벡터 설계, rAAV 생산 품질, 투여 방식, 용량 선택과 실험 조작 등이 실험의 성공 여부를 결정짓기 때문이다. rAAV 체내 유전자 조작 실험의 핵심 세부 사항을 여러분과 함께 검토해보겠습니다.

 

혈청형과 프로모터(promoter) 선택은 전기 실험 방안 설계의 관건

목적 유전자를 특정 조직에서 효율적으로 표현하기 위해서는 미리 실험 계획을 세워야 한다. 그중에서 가장 중요한 것은 적절한 혈청형과 프로모터(promoter)를 선택해야 한다는 것이다. rAAV 의 흡착, 침입, 세포 내 수송, 프로테아제 분해, 핵, 탈의껍질 등의 절차가 모두 외피단백질(capsid protein)과 관련이 있기 때문에 혈청형 구조는 rAAV 의 감염 효율과 표적특이성 등 기본적인 능력을 결정한다. 우리는 실험 수요에 따라 적합한 혈청형을 선택할 수 있다. 아래 표는 Cyagen이 정리한 흔히 볼 수 있는 혈청형의 조직 표적성에 대한 총결이다.

 

혈청형

표적 조직

rAAV1

근육, 심장, 신경, 골격근

rAAV2

근육, 간, 뇌조직, 눈, 신경

rAAV5

폐, 눈, 신경, 췌장

rAAV6

폐, 심장

rAAV7

근육, 간

rAAV8

근육, 간, 신경, 눈

rAAV9

심장, 근육, 폐, 간, 신경

rAAV-rh10

간, 혈액, 심장, 체외세포

rAAV2-retro

신경세포(역방향 비시냅스)

rAAV-DJ

망막, 폐, 신장, 체외세포

rAAV-DJ-8

간, 눈, 중추신경

rAAV9-CNS

중추신경계

rAAV9-PNS

주위신경계통

 

특이성 프로모터는 목적 유전자를 특정 조직과 세포 유형에서 발현시킬 수 있기 때문에 우리는 특이성 프로모터를 선택하여 목적 유전자 전달의 특이성을 더욱 높일 수 있다. 일부 개조된 특정 프로모터를 선택할 수 있다. 예를 들어 강화 시퀀스의 특정 프로모터가 융합된다. 이러한 특정 프로모터는 종종 조직의 특이성을 보장하면서 높은 프로모터 활성을 갖다. 또 가능한 한 짧은 길이의 프로모터를 사용해 목적 유전자의 적재 용량을 늘렸다. 아래 표는 Cyagen이 정리한 흔히 볼 수 있는 특이성 프로모터 및 그 표적성에 대한 총결산입니다. 모두가 참고할 수 있도록 한다.

 

조직

프로모터 이름

응용

신경

hsyn

뉴런 특이성 프로모터

CamKlla

대뇌 신피질과 해마 흥분성 뉴런의 특이적 프로모터

췌장

PDX1

췌장 베타세포 특이적 프로모터

Ins2

췌장 베타세포 특이적 프로모터

심장

cTNT

심근특이성 프로모터

aMHC

심장 특이성 프로모터

Rpe65

망막색소상피세포특이 프로모터

VMD2

망막색소상피세포특이 프로모터

간장

TBG

간장 특이성 프로모터

ApoEHCR-hAAT

간장 특이성 프로모터

혈관

CD68

단핵 대식세포 특이적 프로모터

Cd144

혈관내피세포 특이적 프로모터

Tie1

내피세포 특이적 프로모터

SM22a

혈관 평활근 특이적 프로모터

신장

NPHS1

신장특이성 프로모터

근육

MCK

근육세포특이 프로모터

 

전문적인 실험 조작은 주사 효과에 중요한 영향을 미친다

적절한 혈청형과 적절한 벡터 설계를 선택하는 것은 실험 성공의 기본 전제일 뿐이며, 투여 방식, 투여 용량, 실험 조작 등도 우리 실험의 성패에 중요한 영향을 미친다.

주사 방식은 체계적 투여와 부분적 투여로 나뉜다.또 후미정맥주사, 복강정맥주사, 안와정맥주사, 경부정맥주사 등이 계통적으로 투여된다. 국부 주사 방식은 뇌 입체위치 주사, 근육 부위 주사, 심근 제자리 주사, 유리체강 내 주사, 관절강 주사 등이 일반적이다. 체계적 투여는 간단하지만 바이러스가 체내에서 무작위로 표적 조직에 퍼지는 데 의존하기 때문에 바이러스 양이 많다. 국부 주사에 필요한 바이러스의 양은 적고, 보통 100ul 이내이지만, 역가에 대한 요구가 높다. 표적조직에 rAAV를 직접 투여하기 때문에 국소 투여가 더 좋은 표적성이 있다. 실제 수요에 따라 적절한 사출 방법을 선택할 수 있다. 다음 표는 Cyagen 정리된 일반적인 사출 부위에 대한 효과적인 사출 방법으로 참고할 수 있다.

 

주사부위

주사 방법

뇌조직

좌심실 주사/측뇌실 주사

심근 조직

꼬리 정맥 주사, 목정맥 주사, 심근 원점 주사

간장

후미정맥주사, 문정맥주사(Portal vein injection)

폐장

Nasal drop through respiratory tract, 후미정맥주사

신장

Renal pelvis localization injection, 후미정맥주사

췌장

복강 주사

복부 지방

복강 주사

피하지방

In situ injection ,관장(clyster )

후미정맥주사

혈관

복부 대동맥 국소 감염, 꼬리 정맥 주사

 

실제 조작 과정에서는 조작 절차와 세세한 부분까지 자세히 이해해야 한다. 특히 난이도를 가진 일부 국소주사 방법은 흔히 배를 열고 미세조직을 찾는 등의 조작을 수반하며 실험조건과 조작방법에 대한 요구가 비교적 높고 약간의 실수가 있으면 생쥐가 비교적 큰 손상을 입게 되어 실험결과에 영향을 준다. 다음에은 주사방식의 애로사항 및 주의사항을 몇 가지 알려드립니다.

 

젖쥐 측두정맥주사

1.작은 크기: 갓 태어난 젖쥐는 몸무게가 1g 정도 밖에 되지 않다.

2.혈관 가늘기: 측두정맥은 실처럼 가늘고 귀 앞쪽 깊은 곳에 분포하며 보일 듯 말 듯한다.

3.마취가 어렵다: 신생 마우스는 마취제를 통해 마취할 수 없다. 냉동마취가 필요한다. 냉동시간이 너무 짧으면 마취할 수 없다. 냉동시간이 너무 길면 마우스는 사망한다.

4.간호난: 젖쥐는 주사 후 즉시 보온해야 하며, 어미 쥐는 젖쥐의 냄새 변화로 새끼를 키우지 않고 잡아먹기도 한다.

 

 

그림 1. 신생아 생쥐 측두정맥주사

 

뇌정위주사

1.좌표의 변화가 크다: Rat와 Mouse는 성년이 되기 전에 뇌가 끊임없이 발달하고 뇌 영역의 좌표도 끊임없이 변화한다.

2.주사 부위가 많음: 뇌에서 주사할 수 있는 부위는 해마체, 측뇌실, 제3뇌실, 문상체 등을 포함하며 같은 부위의 좌표를 주사해도 일정하지 않다.

3.체위 고정이 어렵다: Rat와 Mouse는 코클립, 귀마개 등의 도구를 통해 머리를 고정시키고, 또한 여러 번 제곱을 조절하여 좌표를 시작할 수 있다.

4. 두개골을 뚫기 어렵다: 전문 드릴 및 적합한 드릴로 두개골에 구멍을 뚫어야 한다. 구멍 뚫는 속도가 너무 낮으면 두개골을 뚫기 어렵다. 속도가 너무 높으면 뇌막을 뚫어 뇌출혈을 일으킬 수 있다.

 

 

그림 2. 뇌정위주사

 

간문정맥주사

1.조작이 복잡다: 복부수술을 하고 장을 복강 밖으로 옮기고 간 및 췌장이 취약하기 때문에 간문정맥을 찾아내려면 동작이 가벼워야 한다.

2.쉽게 침투: 간문정맥이 크고 충만하여 혈관을 천자하여 투여하면 혈관이 비가역적으로 손상되기 쉬우며 지속적 침투 또는 폭발적인 출혈이 나타나 생존율이 떨어진다.

3.간호난 : 수술 중 감염의 위험이 있으므로 수술 후 항생제를 투여하고 동물이 깨어날 때까지 보온한다.

 

기관(trachea)내 주사

1.Noninvasive endotracheal intubation입안을 통해 생쥐의 기도에 삽입하는 것은 어느 정도 기교성이 있어야 하며 삽관 실패 시 후두가 붓거나 식도에 잘못 삽입되기 쉽다.

2.Invasive injection노출기관에는 목구멍이 열려 있어 기관 위쪽 근육이 파열되고 바늘이 들어가도 기관손상, 마우스 호흡이 원활하지 않다.

 

꼬리정맥주사

꼬리 정맥주사 실패는 꼬리 부분에 바이러스가 남아 전체 바이러스 투여량과 영상 결과에 영향을 줄 수 있다(그림3의 네 번째 생쥐).

 

 

그림 3. 꼬리 정맥 주사

 

결론

성공적인 한 번의 rAAV 체내 유전자 조작 실험은 여러 가지 요소를 고려해야 한다. 초기에는 대량의 자료를 찾아 혈청형과 프로모터를 선택해 합리적이고 과학적인 방안을 설계하고 높은 점적도의 감염효율의 rAAV를 생산해야 한다. 또한 숙련된 실험 조작 스킬과 전문 소양을 가지고 있어야 효과적으로 rAAV를 체내에 전달하여 목적 세그먼트를 효과적으로 표현할 수 있다.

 

Cyagen 유전자치료 원스톱 솔루션

 

 

 

Cyagen는 종합 솔루션 제공업체로서 여러 명의 일체형 유전자 치료 혁신적 CRO 플랫폼 서비스 네트워크를 구축했다. 지난 10여 년 동안 Cyagen는 대량의 유전자 정보 데이터를 축적했다. 패턴동물의 지속적인 연구에서도 우리는 유전자 편집 기술 방면에서 업계 선두에 서 있다. Cyagen의 인공지능 분야 심층 탐구와 결합하면 효율적인 유전자 기능 해석과 유전자 치료 원스톱 솔루션을 제공할 수 있다. 유전자 치료에 종사하는 연구자에게 보다 효율적인 유전자 기능 해석과 유전자 치료 원스톱 솔루션을 제공할 수 있으며, 표적 선별과 기능 연구, 동물 모델 구축과 AAV, LV, ADV 등의 바이러스 벡터의 설계와 포장, 그리고 표현형 분석 등의 전 프로세스 서비스를 제공한다.

 

Cyagen AI 분야의 강점을 결합해 희귀질환 데이터센터(RDDC)를 통해 안과 희귀질환에 대한 역학 데이터, 약물의 발달개황, 안과질환 관련 유전자 데이터, 안과 유전자 돌연변이 부위 및 생쥐 모델 등의 데이터를 조회할 수 있으며 AI를 활용한 안과질환 병원성 예측도 가능한다. 필요하신 분들은 백스테이지에 댓글 달거나 문의해주세요~

 

 

 

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