연구에 적합한 마우스 모델 및 유전자 변형 방법을 어떻게 선택해야 하는가?

유전자 변형 마우스의 종류는 매우 많으며, 실제 응용단계에서는 좋은 실험 결과를 얻기 위해 연구의 내용과 목적에 따라 적합한 유전자 변형 마우스를 선택해야 한다. 우리는 일반적으로 마우스 strain, 변형된 유전자, 변형 방법 및 제작 기술 측면에서 연구 내용에 따라 적합한 유전자 변형 마우스를 선택한다. 따라서 본 논문에서는 연구에 가장 많이 사용되는 두 종류의 마우스 strain인 C57BL/6과 BALB/c에 대해 논의하고자 한다.

1. 연구에서 자주 사용되는 두가지 마우스 strains: C57BL/6 및 BALB/c

유전자 변형 마우스에 대해 선택할 때, 왜 어떤 연구에서는 대부분 흰색 생쥐를 선택하는 반면, 어떤 연구에서는 검은색 생쥐를 선호하는가? 이것은 배경 strain이 다른 유전자 변형 마우스의 표현형이 매우 큰 차이가 있을 수 있기 때문이다. 이러한 차이는 완전히 다른 표현형, 표현형의 침투도 변화 또는 표현형의 가변적인 발현으로 표현될 수 있다.

실험용 마우스는 근교계와 비근교계로 나뉜다. 비근교계는 이형접합률이 높고 개체 차이가 큰 반면에, 근교계는 homozygous 마우스이고, 유전적으로 안정적이며, 일치한 표현형 및 확인 가능한 명확한 배경 정보를 가지고 있음으로 대부분의 생물의학 연구에 사용된다. 현재 실험실에서 가장 일반적으로 사용되는 근교계 마우스 strain은 C57BL/6 및 BALB/c이며 이 두 종류의 마우스에 대해 선택할 때는 일반적으로 면역학의 차이를 고려한다. 그러면 이 두 종류의 마우스는 어떤 특징을 가지고 있는가? 면역학적 관점에서 그들 사이의 주요 차이점은 무엇인가?

1)C57BL/6

C57BL/6 마우스는 인간에 이어 두 번째로 유전자 서열분석(genome sequencing)을 마친 포유동물이며, 국제마우스표현형분석컨소시엄 (IMPC, International Mouse Phenotyping Consortium)은 그의 유전자에 대한 기능 분석을 진행해 왔다. 또한 C57BL/6 마우스는 근교계 마우스로써, 유전적 배경이 일치하고 개체 간에 발현 또는 표현형의 변화는 유전적 배경의 차이에 기인할 수 없으므로, 대부분의 site-directed modification 및 transgenic 프로젝트에서 우선적으로 선택되는 마우스 strain이다.

      특징:

• 다양한 종양의 낮은 발생률: 유방암의 자연 발생률은 낮으며 (0%-1%) 발암 물질로 암을 유발하기가 어렵다. 노화마우스에서 자발적인 림프종의 비율은 20%-25%이고, 암컷 마우스의 자발적인 백혈병 비율은 7%-16%이며, 조사 후 간암의 발생률이 높다.
• 방사능에 대한 적당한내성을 가지고 있다.
• 보체활성(complement activity)이 높다.
• 면역 내성을 유발하기 쉽다.
• 결핵균에 민감하며 mousepox바이러스에 어느 정도 내성이 있다.
• 인터페론생산량이 높다.
• 알코올성이 높고, 에피네프린의 농도가 낮으며 백일해(pertussis)의 히스타민 감수성 인자에 민감하다.
• 식이 유발 비만(diet-induced obesity, DIO)및 만성 실험적 자가면역 뇌수막염(experimental autoimmune encephalomyelitis, EAE) 다발성 경화증(multiple sclerosis, MS) 모델의 연구를 위한 바람직한 모델이다.
• 대식세포는탄저병 치사 독소의 작용에 내성을 갖고 있다.

주의해야 할 점은 C57BL/6의 여러 아계(substrain) 간에는 많은 차이가 있다는 점이므로, 적용시 그것들의 차이점에 대해 자세히 알아야 한다.

2) BALB/c

BALB/c 마우스는 종양, 염증 및 자가면역 등 연구 분야에서 가장 많이 사용되는 동물이며, 현재 세포융합에 사용되는 마우스 골수종 세포는 거의 모두 BALB/c 마우스에 속한다.

     특징:

• 미네랄 오일로 인한 형질 세포종에 민감하다.
• BALB/c 비장세포에서 유래된 하이브리도마에흔히 사용되어 단일클론성항체(monoclonal antibodies, mAbs)를 생성한다.
• 유방암 발병률(3%)이 낮은 반면, 유방암바이러스(mammary tumor virus, MMTV)에 의해유도되면 발병률이 높아진다.
• 나이가 들수록 다른 암(폐암, 신장암)에 걸릴 확률이 크게 증가하며 난소, 부신 종양 및 백혈병발생의 가능성이 있습니다.
• 대부분의마우스는 생후 6개월 후에 면역글로불린 증세가 나타나는데, 주로 IgG1과 IgA의 증가, 낮은 인터페론 생산량, 높은 보체활성(complement activity)으로 표현된다.
• 리스테리아 모노사이토제니스(Listeria monocytogenes)에 감염되기 쉽다.
• Hc1 대립 유전자를 가지고 있기 때문에크립토코커스 네오포르만스(Cryptococcus neoformans)를 억제 할 수 있다. 리케차(rickettsia)에 의한 발열, 홍역 바이러스, 리슈만편모충(leishmania), 만손주혈흡충(schistosoma mansoni)에 민감하며 톡소플라스마원충(Toxoplasma gondii)에 대한 감수성이 강하다.
• 폐렴에 걸리기 쉬우므로 다른 근교계 마우스와 같은 방에서 기르지 않는 것이 좋다.

2. C57BL/6 마우스와 BALB/c 마우스의 면역학적 차이

• C57BL/6마우스와 BALB/c 마우스는 Th1과 Th2 면역반응에서 다르다. C57BL/6 마우스에서 Th1 면역반응 및 IFNγ 생성이 지배적인 반면, BALB/c 마우스는 Th2 면역반응을 유발하기 쉬우며 이는 전염병 및 알레르기 반응에서 흔하다.
• BALB/c마우스는 C57BL/6 마우스에 비해 더 강한 체액 반응을 나타내는 경향이 있다.
• 이 두 strain은 MHC 클래스Ⅰgene locus의 H2 locus에서 서로 다른 유전자 서열을 가지고 있다- BALB/c마우스는 H2d이고, C57BL/6 마우스는 H2b이다. 둘이의 유전자 서열의 차이는 H2 locus에 있다. 그러나 일부 항혈청 또는 항체는 이들의 차이를 구별하지 못하며 두 strain의 세포에 모두 반응할 수 있다. 또한 일부 단일 클론 항체는 MHC 하플로타이프를 구별하는 데에 사용될 수 있다.
• 수지상세포(dendritic cells, DCs)에 의한인터루킨 12(IL-12)의 조기 생성의 차이는 C57BL/6 마우스와 BALB/c 마우스가 리스테리아 모노사이토제니스(Listeria monocytogenes)에 대한 민감성 차이의 기초이다.

이처럼 C57BL/6 마우스와 BALB/c 마우스는 모두 근교계의 유전적 배경이 일치한다는 장점이 있지만 면역학, 종양 및 전염병 등의 연구에 적용할 때는 이들 사이에 존재하는 많은 차이를 고려해야 하며 연구 내용과 목적에 따라 선택해야 한다.

3. 제작 기법의 선택

배경 strain의 선택에 대한 이야기에 이어 다음으로 제작 기법의 선택에 대해 간단히 말씀드리고자 한다. CRISPR/Cas9 기법은 제작기간이 짧고 간편하며, 저렴하고 다양한 동물종에 사용될 수 있다는 장점이 있다. 반면에 단점은 off-target effect가 있으며 특허분쟁 등 문제가 있을 수 있다는 것이다. ES Cell Targeting 기법은 정확하고 off-target effect가 없으며 여러 복잡한 gene modification을 할 수 있는 장점을 가지고 있는 반면,  단점은 비용이 많이 들며, 마우스에만 적용된다는 것이다. 따라서 일반적인 Conventional Knock-Out 마우스 모델, Knock-In 마우스 모델 및 C57BL/6 외에 다른 종의 모델을 제작 시, CRISPR/Cas9 기법을 선택하는 것을 권장하나 복잡한 마우스 모델 제작 프로젝트에서는, 여전히 ES Cell Targeting 기법을 기반으로 한 TurboKnockout^® 기술을 선택하는 것을 추천한다.

일반적으로, 연구 방향과 목적에 따라 최선의 선택은 ES Cell Targeting 기법을 사용하여 BALB/c 마우스에 유전자 조작을 진행하는 것이지만, ES Cell Targeting에 사용될 수 있는 성숙한 ES cell line은 보통 몇 가지 strain만 있다: C57BL/6, 129S3 및 C57BL/6J x 129 F1 hybrids. 또한 CRISPR/Cas9 기법을 선택하면 특허분쟁, off-target effect 등 문제가 있다. 그러면, 이러한 단점을 피하고 기술의 장점을 최대한 살리는 것이 가능한가?

이러한 문제에 대하여 두가지 방법이 있다. 먼저 ES Cell Targeting 기법으로 C57BL/6 마우스를 유전자변형시킨 다음에 wildtype BALB/c 마우스와 10세대 이상 역교배를 시키는 우회적인 방법이 있지만, 이는 번식 및 검정하는 데에 많은 시간과 신경이 쓰이게 된다. 또 다른 방법은 BALB/c strain의 배아줄기세포 배양의 어려움과 ES Cell Targeting 방식으로 모델을 제작하는 것이 난이도가 높은 문제를 직접 해결하는 것이다. Cyagen은 2년 반에 걸쳐 BALB/c strain인 여러 batch의 배아줄기세포를 선별했으며, 성별 검정, 핵형 안정성 테스트, 전형성능 테스트, 생식 키메라 능력 테스트 및 최종 생식세포계열 키메라현상 등이 포함된 다수의 테스트를 진행하였다. 이를 통하여 안전한 시드 세포를 screening하며 BALB/c strain의 ES Cell Targeting 모델 제작을 성공적으로 달성하였다. 

제작 기법의 선택에 대한 자세한 내용은 이전 글 ‘CRISPR/Cas9과 ES Cell Targeting 중에 나에게 더 적합한 기술은 무엇일까? 어떻게 선택해야 가장 좋을까?’를 통하여 확인할 수 있습니다.

귀하의 연구에 BALB/c 마우스 모델 제작 서비스가 필요하신다면 언제든지 편하게 연락주시길 바랍니다.