비만과 공복(Hunger)은 복잡한 신경 및 호르몬 조절 메커니즘이 얽혀 있는 두 가지 밀접하게 연관된 생리적 상태입니다. 이러한 대사 기전을 연구하는 데 있어, 공복(Hunger) 신호에 민감한 NPY/AgRP 뉴런은 중요한 역할을 합니다. 본문에서 시상하부의 궁상핵(Hypothalamic Arcuate Nucleus, ARC)을 타겟으로 하는 Agrp-IRES-CreERT2-P2A-tdTomato Cre inducible fluorescent reporter 마우스 모델(제품 번호: C001558)을 소개합니다.
공복(Hunger) 조절에서의 NPY/AgRP 뉴런
NPY/AgRP 뉴런은 뇌에서 시상하부의 궁상핵(ARC) 내에만 존재하며, 이들은 렙틴과 인슐린의 수용체를 발현하고, 이러한 호르몬의 존재에 의해 억제되기 때문에 배고플 때 매우 활발하게 활동합니다. NPY/AgRP 뉴런은 신경펩타이드 Y(NPY) 신호를 증가시키고 멜라노코르틴(melanocortin) 신호를 억제하여 펩타이드 물질을 생성하는 AgRP(Agouti-related Protein)을 방출함으로써 식욕을 효과적으로 자극합니다. [1]
AGRP 유전자에 의해 인코딩되는 아구티 관련 단백질(AgRP)은 NPY/AgRP 뉴런이 되에서 생성되는 신경펩타이드로, 주로 시상하부의 궁상핵(ARC), 신장, 부신 증 부위에서 발견됩니다. 아구티 관련 단백질(AgRP)은 시상하부 궁상핵(ARC) 내의 복측 부분에 신경펩타이드 Y(NPY)를 포함하는 세포체에서만 합성됩니다. 아구티 관련 단백질(AgRP)과 신경펩타이드 Y(NPY)는 함께 발현되어 식욕 증가, 대사 감소, 에너지 소비 저하에 중요한 역할을 합니다. 이러한 이유로 AgRP는 가장 효과적이고 지속적인 식욕 자극제로 알려져 있습니다.
그림 1. NPY/AgRP 뉴런은 시상하부의 궁상핵(ARC) 내에 위치합니다. [2]
Agrp-IRES-CreERT2-P2A-tdTomato 마우스 모델의 유전자 배경 및 기능
Cyagen은 독자적으로 개발한 유전자 편집 기술을 활용하여 Agrp-IRES-CreERT2-P2A-tdTomato Cre inducible fluorescent reporter 마우스 모델(제품 번호: C001558)을 개발했습니다. 이 모델은 마우스 내인성 Agrp 유전자 조절 요소에 의해 Tamoxifen-inducible CreERT2 재조합효소(recombinase)를 발현합니다. 추가로, 해당 계통의 마우스 모델의 CreERT2 재조합효소(recombinase) 발현 요소 뒤에 빨간 형광 단백질(tdTomato) 발현 요소가 이어져 있어, Agrp-positive 세포의 계통 추적에 적용합니다.
Tamoxifen을 사용하기 전에 CreERT2 재조합효소(recombinase)는 세포질에만 존재합니다. Tamoxifen을 사용한 후, CreERT2 재조합효소(recombinase)는 세포핵으로 들어가 재조합효소(recombinase) 기능을 수행합니다.
Agrp-IRES-CreERT2-P2A-tdTomato 마우스가 loxP 사이트를 가진 마우스와 교배되면, Tamoxifen 유도를 통해 자손 마우스의 AgRP-positive 뉴런에서 loxP 사이트 사이의 RMCE(Recombinase-Mediated Cassette Exchange)를 유발할 수 있습니다. 이 방법은 NPY/AgRP와 관련된 비만 연구를 위한 조건부 CreERT2 유도 형광 표지 마우스 모델 개발을 가능하게 합니다.
시상하부에서 형광 단백질 발현을 성공적으로 유도합니다.
교배 실험에서, Agrp-IRES-CreERT2-P2A-tdTomato 마우스와 ZsGreen 형광 단백질을 조건부로 발현하는 LSL_ZsGreen 마우스를 교배했습니다. Tamoxifen으로 유도한 후, 자손 마우스의 시상하부 조직을 동결 절편으로 제작하여 ZsGreen 단백질의 자발 형광을 관찰했습니다. 그 결과, Tamoxifen 처리를 받은 Agrp-IRES-CreERT2-P2A-tdTomato; LSL_ZsGreen 이중 양성 마우스에서 시상하부의 궁상핵(ARC) 영역에 국한된 자발적인 녹색 형광 신호가 관찰되었습니다.
그림 2. 시상하부에서 Cre 재조합효소(recombinase)의 발현 결과
tdTomato와 ZsGreen 형광 단백질의 Co-localization 발현
tdTomato 단백질 발현의 세포 유형 특이성을 확인하기 위해 면역형광(Immunofluorescence, IF) 염색을 수행했습니다. 그 결과, Tamoxifen으로 치료된 Agrp-IRES-CreERT2-P2A-tdTomato; LSL_ZsGreen 이중 양성 마우스의 시상하부 내에서 tdTomato(빨간 형광 단백질)와 ZsGreen(녹색 형광 단백질) 신호가 모두 검출되었습니다. 또한 Cre 재조합효소(recombinase)에 의해 유도된 ZsGreen 신호는 마우스 내인성 Agrp가 조절한 tdTomato 형광 신호와 공동 위치했습니다. 결과에 따르면 이 모델에서 Cre 재조합효소(recombinase)의 발현 패턴이 마우스의 내인성 Agrp 발현과 일치합니다.
그림 3. 시상하부에서 ZsGreen(녹색 형광 단백질)과 tdTomato(빨간색 형광 단백질)의 Co-localization 발현 결과
결론
Agrp-IRES-CreERT2-P2A-tdTomato 마우스 모델(제품 번호: C001558)은 시상하부의 궁상핵(ARC) 내에서 정확한 Cre 재조합효소(recombinase) 발현을 가능하게 합니다.
교배 실험에서 Tamoxifen으로 유도된 이중 형광 단백질의 발현은 Agrp-IRES-CreERT2-P2A-tdTomato 마우스 모델의 특이성을 확인하여 AgRP 유전자와 NPY/AgRP 뉴런에 초점을 맞춘 비만 연구에 탁월한 연구 모델이 될 수 있다는 사실을 입증했습니다.
종합적인 Cre Driver 및 KO/cKO 마우스 모델
상기 소개한 RES-CreERT2-P2A-tdTomato 유도형 마우스 모델 외에도 Cyagen은 연구자들을 위해 종합적인 연구 리소스로 활용할 수 있는 자사 개발한 설치류 모델 라이브러리를 지속적으로 확장하고 있습니다. Cyagen의 Knockout Catalog Models Repository(eBank)는 다양한 연구 응용에 이용할 수 있는 유전자 Knockout(KO) 및 조건부 Knockout(cKO) 마우스 계통을 제공합니다. Cyagen의 다양한 KO/cKO 마우스 모델에 대해 자세히 알아보려면 Knockout Catalog Models Repository(eBank)를 방문해 주시기 바랍니다.
또한, Cyagen은 다양한 조직에서의 정확한 유전자 편집을 지원하기 위해 iCre 및 CreERT2를 포함한 전문적인 Cre driver 마우스 모델을 제공합니다.
참고 문헌:
[1] Morton GJ, Schwartz MW. The NPY/AgRP neuron and energy homeostasis. Int J Obes Relat Metab Disord. 2001 Dec;25 Suppl 5:S56-62.
[2] Han J, Liang X, Guo Y, Wu X, Li Z, Hong T. Agouti-related protein as the glucose signaling sensor in the central melanocortin circuits in regulating fish food intake. Front Endocrinol (Lausanne). 2022 Nov 1;13:1010472.
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