NLRP3 and Familial Cold Autoinflammatory Syndrome

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NLRP3유전자 소개

Nlrp3 유전자 인코딩 pyrin 모양 단백질,단백질은 pyrin 도메인을 포함합니다.하나의 단백질 pyrin 도메인을 담고, 하나 뉴클레오티드 (NBS) 결합 바인딩 사이트(binding site) 도메인, 하나의 leucine rich repeat(LRR) 서열.이 단백질은 죽음과 관련된 스팟모양 단백질인 PYCARD/ASC와 상호작용하며 PYCARD/ASC는 하나의 caspase 모집역을 포함하고 있으며 NLRP3 염증소체 복합체의 구성원입니다.이 복합물은 NF-kappaB 신호의 upstream activator sequences로 염증, 면역반응, 세포 시들어가는 조절에 작용을 발휘합니다.

그림1. 염증소체의 분자 메커니즘 설명도[1]

IL-1β, 내원성 열원이라고도 하며, 고도의 염증 세포인자입니다.그 발생은 적어도 세 가지 다른 절차의 엄격한 통제를 받는다.첫 단계는 pro-IL-1β단백(p35)의 발생을 다루며 pro-IL-1β 전체를 생성하여 활성 IL-1β 단백(p17)을 생성하고 마지막으로  IL-1β를 세포 밖으로 방출합니다.중간 단계, 즉 pro-IL-1β 가공,활성화 caspase-1 활성화 복합체,염증소체가 가장 좋은 특징입니다.NLRP3 염증소체는 활성화되지 않은 pro-caspase-1을 활성화된 Caspase-1로 가공합니다.pro-IL-1β를 잘 익은 IL-1베타로 분해합니다.염증과 세포의 너무 일찍  사망을 초래합니다.

Cryopyrin 을 코딩한 유전자 NLRP3 의 명백한 유전적 돌연변이는 일련의 염증 질환의 원인으로 증명되었습니다.가족감기 자체 염증증후군  (FCAS)、Muckle -Wells 증후군(MWS) , 신생아 다중 시스템 염증질환 (NOMID) 을 포함해 현재 냉열단백질 관련 주기성 증후군 (CAPS) 으로 통칭되고 있습니다.

표 1. FCAS의 기본 정보

비고: √ 라고 표시된 것은 Cyagen  마우스 창고에 보존된  마우스입니다

Familial Cold Autoinflammatory Syndrome

가족성 추위 자가염증후군(FCAS)은 드물게 유전성 염증성 질환입니다.간헐적으로 발작하는 발진, 발열, 관절통과 기타 추위에 드러나 생기는 전신성 염증의 상징/증상 FCAS의 발병은 영아기와 유아기에 발생하며 환자의 일생 동안 지속되는 것이 특징입니다.FCAS는 보통 상염색체 발현성 유전조건에서 유전되며 냉단백질(NALP3) 단백질을 코딩하는 CIAS1-NLRP3 유전자 속 잡합 돌연변이에 의해 발생합니다.이 유전자의 돌연변이가 냉단백질을 함유한 단백질 복합물의 활성화를 증가시킬 수 있다고 가정해 봅시다. 이런 단백질 복합물은 염증 소체라고 불리며 체내 염증을 조절할 수 있습니다.염증 소체활성이 증가하여 IL-1ß이라고 하는 단백질의 방출이 증가하여 발열과 관절통과 같은 염증 증상을 초래합니다.

FCAS는 새로 발견된 질환이기 때문에 실제 발병률을 현재로서는 알 수 없습니다.신생아 다중 시스템 염성 질환 (NOMID) 과 Muckle-Wells 증후군(MWS) 증상은 FCAS 의 증상과 비슷할 수 있으며 뚜렷한 표형이 겹칠 수 있습니다.가족성 추위 자가염증후군 1 (FCAS1) 은 NLRP3 유전자의 잡합 돌연변이로 인해 염색체 1q44 에 위치하고 있습니다.또한 FCAS2 는 염색체 19q13 에 있는 NLRP12 유전자 돌연변이로 인해 발생합니다. FCAS3 은 염색체 16q23 에 있는 PLCG2 유전자 돌연변이로 인해 발생합니다. FCAS4 는 염색체 2p22 의 NLRC4 유전자 돌연변이로 인해 발생합니다.

그림 2. cryopyrin-associated periodic syndromes CAPS 의 임상 스펙트럼 [2]

표 2. FCAS 질병 관련 정보

Nlrp3 유전자 편집 마우스 표현형

1.점 돌연변이 모형

알라닌352에서 발린(A352V),류신353에서 프롤린 (L353P)으로의 돌연변이는 각각 클래식 MWS 와 FCAS 환자와 밀접한 관련이 있지만 겹치는 증후군 환자에서는 별로 관련이 없습니다.ES 표적 기술을 통해 두 개의 점 돌연변이 마우스 모델을 생성합니다.Nlrp3 A350V와 Nlrp3 L351P. 내함자 속 Neo 의 존재로 유전자의 정상적인 표현을 차단하고, 각기 다른 가동자를 통해 Cre 재조합 효소를 표현하는 마우스의 매개체 Neo가 서로 다른 부위에서 돌연변이를 삭제하고 표현합니다.

그림 3. Nlrp3 점 돌연변이 마우스 타깃 전략 [3] 

Nlrp3 A350V/+ / CreZ (배아기 제거 Neo 및 돌연변이 유전자표현) 새끼는 생후 1 ~ 2 일 또는 그 이전에 염증표형을 나타내고, 4 일째에는 피부농양이 나타나고 비늘 모양의 홍반이 나타났습니다 (그림 3A).또 이들 마우스는 나흘째 성장이 지연되고 색소침착과 모발 성장이 부족한 것으로 나타났습니다.Nlrp3 A350V/+ / CreL(골수 세포주는 Neo 를 제거하고 돌연변이 유전자를 표현함) 새끼는 비슷한 표현형을 보여 주지만 사망률 역학이 다르기 때문에 이들 마우스 중 70% 가 7-9 일째까지 살아남아 증가된 속도로 사망합니다.

그림 4. Nlrp3 점 돌연변이 마우스 관련 표현형 데이터 [3]

MWS 환자에게 관찰된 두드러기 같은 병변과는 다르지만 A350V 를 표현하는 새끼에서 관찰된 피부 홍반, 농양, 비늘은 잠재적 염증이 있음을 보여준다.돌연변이 생쥐는 전체 백혈구 수가 가볍게 높아졌을 뿐 중성입세포와 혈소판이 많아진 것은 분명합니다.CAPS 환자들 사이에선 이 같은 혈액학적 피부검사 결과가 공통적으로 묘사됩니다.Nlrp3 A350V/+/CreL 아기에게서 온 염증피부절편은 IL-1베타와 IL-6의 면역조직화학을 진행하였습니다.두 가지 세포인자(주로 진피에서 IL-1 베타와 표피에서 IL-6)의 표현이 증가하며, 캡스 환자들로부터의 피부 생검과 일치하며, 이들 세포인자가 피부병리학에서 차지하는 역할을 암시합니다.TNFα는 앞서 묘사된 캡스 환자와 큰 차이가 없습니다.

그림 5. Nlrp3 점 돌연변이 마우스 혈청과 피부 속 다양한 세포인자 상향 조절 [3]

2. 녹아웃 마우스 모형

ES 타깃 기술을 통해 Nlrp3 (Cias1) ES 녹아웃 마우스 모델을 생성하고 ATG 시작 위치에 EGFP 를 삽입하여 녹아웃 목적 달성:

그림 6. Nlrp3 유전자 녹아웃 마우스 타깃 전략 [5]

야생형, Nlrp3+/-및 Nlrp3-/-대식세포는 상당한 수의 pro-IL-1β를 생성하지만, 그들의 야생형 대응물과는 달리 Nlrp3-/-대식세포는 ATP 처리 후 pro-IL-1β을 자르지 않았습니다.Cryopyrin 은 ATP 유도 caspase-1 활성화에 매우 중요하다는 것을 보여줍니다.LPS 또는 Pam3CSK4로 인한 야생형 대식세포는 나이지리아 균이나 maitotoxin에서 IL-1β와 IL-18을 분비하는데 비해 Asc-/-와 Nlrp3-/- 대식세포는 모두 눈에 띄는 IL-1β 또는 IL-18을 배출하지 못하고 있습니다.

CAPS의 치료

 대부분의 경우 캡스는 NLRP3 유전자 돌연변이에 의해 발생합니다.바뀐 유전자 결과물인 cryopyrin은 염증소체를 활성화시켜 IL-1β 발생을 유발합니다.IL-1 β에 의해 CAPS의 염증 발현이 됩니다.IL-1 억제제는 안전하고 효과적인 치료 선택으로 IL-1 억제제의 등장에 따라 이 같은 파괴적인 질병에 안전하고 효과적인 치료 선택지가 제공되고 있습니다.

NSAIDs는 종종 관절 통증 완화에 사용됩니다.고선량인 코르티코스테로이드의 경우 어느 정도 효과가 입증됐지만 단기적, 장기적 부작용을 일으킬 수 있습니다.

Regeneron Pharmaceuticals 의 Arcalyst (Rilonacept) 는 IL-1 차단제입니다.2008 년 FDA 승인을 받아 성인과 12 세 이상 아동을 치료하는 CAPS (FCAS 및 MWS 포함) 를 승인했습니다.

Biovitrum Pharmaceuticals의 Kineret (Anakinra)는 IL-1 수용체 길항제의 일종으로 FCAS 환자에게 널리 사용되고 있어 임상효과가 매우 높습니다.그러나 현재 FCAS나 어떤 캡스 질환 치료에도 쓰이고 있지 않습니다.

결론

향후 연구는 cryopyrin 의 활성화 돌연변이가 어떻게 염증소체의 정상적인 조절을 피하여 가족성 감기 자체 염증 증후군, Muckle-Wells 증후군, 신생아 다중 시스템 염증성 질환과 같은 염증성 질환을 생산할 수 있는지 해결해야 합니다.한 가지 흥미로운 가능성은 낮은 수준의 세균 감염과 불균형한 냉열단백질 반응이 이러한 질병과 관련된 증상을 유발할 수 있다는 것입니다.

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참고 문헌:

1. Stojanov S, Kastner DL. Familial autoinflammatory diseases: genetics, pathogenesis and treatment. Curr Opin Rheumatol. 2005 Sep;17(5):586-99. doi: 10.1097/bor.0000174210.78449.6b. PMID: 16093838.

2. Sutterwala FS, Ogura Y, Szczepanik M, Lara-Tejero M, Lichtenberger GS, Grant EP, Bertin J, Coyle AJ, Galán JE, Askenase PW, Flavell RA. Critical role for NALP3/CIAS1/Cryopyrin in innate and adaptive immunity through its regulation of caspase-1. Immunity. 2006 Mar;24(3):317-27. doi: 10.1016/j.immuni.2006.02.004. PMID: 16546100.

3. Kuemmerle-Deschner JB, Haug I. Canakinumab in patients with cryopyrin-associated periodic syndrome: an update for clinicians. Ther Adv Musculoskelet Dis. 2013 Dec;5(6):315-29. doi: 10.1177/1759720X13502629. PMID: 24294305; PMCID: PMC3836377.

4. Brydges SD, Mueller JL, McGeough MD, Pena CA, Misaghi A, Gandhi C, Putnam CD, Boyle DL, Firestein GS, Horner AA, Soroosh P, Watford WT, O'Shea JJ, Kastner DL, Hoffman HM. Inflammasome-mediated disease animal models reveal roles for innate but not adaptive immunity. Immunity. 2009 Jun 19;30(6):875-87. doi: 10.1016/j.immuni.2009.05.005. Epub 2009 Jun 4. PMID: 19501000; PMCID: PMC2759865.

5. Mariathasan S, Weiss DS, Newton K, McBride J, O'Rourke K, Roose-Girma M, Lee WP, Weinrauch Y, Monack DM, Dixit VM. Cryopyrin activates the inflammasome in response to toxins and ATP. Nature. 2006 Mar 9;440(7081):228-32. doi: 10.1038/nature04515. Epub 2006 Jan 11. PMID: 16407890.

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