단일 세포 시퀀싱이 종양 면역 연구에 어떻게 도움이 되는지?

30여 년의 암 연구의 발전을 거쳐 많은 표적 치료법은 이미 각종 종양을 치료하는데 사용 허가를 받았으며, 더 많은 치료법이 개발 중이거나 초기 임상시험 중에 있다. 그러나 암 치료 연구에서 재발성과 내성이 발견돼 약물 개발에 어려움을 겪고 있다. 이 때문에 재발성과 내성에 강한 고효율 약물 개발이 연구 이슈로 떠오르고 있다.

단세포의 돌연변이는 종양 발생의 기초이다. 따라서 복잡한 종양 환경을 각각의 단세포로 이루어진 동적이고 상호작용적인 시스템(종양 미세환경)으로 볼 수 있다. 단세포 시퀀싱 기술(Single-cell sequencing)은 단세포의 게놈을 나타낼 수 있어 종양생물학과 유전학의 이해에 심원한 영향을 끼쳤다.

단세포 시퀀싱(Single-cell sequencing) 무엇을 입니까?

단세포 시퀀싱 기술은 단세포 게놈이나 전사 그룹을 시퀀싱하여 게놈, 전사 그룹의 조직학 정보를 얻어 세포군의 차이와 세포 진화 관계를 밝히는 것을 말한다.

단세포 시퀀싱과 전통적인 시퀀싱 방법의 차이점은 무엇입니까?

전통적인 시퀀싱법은 여러 세포의 게놈이나 전사체를 측정하기 때문에 이들 세포의 평균치만 얻을 수 있을 뿐 세포의 이질성에 대한 정보는 분석할 수 없다. 단세포 시퀀싱 기술은 개별 세포 간 이질성 검출, 소량의 세포 구분, 세포 지도 묘사 등의 장점이 있다.

우리는 간단한 분석을 합니다. 아래 그림과 같이 세 그룹의 세포 중 첫 번째 그룹은 하나의 세포에 현저한 표현형을 가지고 두 번째 그룹의 세포 중 절반은 중간 정도의 현저한 표현형을 가지고 세 번째 그룹은 모두 약한 표현형을 가지고 있다. 이러한 세 그룹의 세포 중 WB를 사용하여 측정한 스트라이프(stripe)는 일치할 수 있으며, 전통적인 시퀀싱 방법으로는 각 그룹 간의 현저한 차이를 얻지 못할 수도 있다.

그룹 1

그룹 2

그룹 3

세 그룹의 세포 WB stripe은 일치할 수 있다

세 그룹의 세포 시퀀싱 결과에는 유의 한 차이가 없을 수 있다

그림1은 세 그룹의 구성 구조가 다른 세포에 대해 WB 분석과 시퀀싱을 실시하여 얻은 결과는 동일할 수 있다. 그림은 BIORENDER에서 생성되었다.

단세포 시퀀싱, 즉 세포 하나하나를 개별적으로 분석하면 세포 지도를 그려 세포 간의 이질성을 검출할 수 있다. 아래 그림과 같이 Memorial Sloan Kettering Cancer Center와 컬럼비아대학교(Columbia University)의 유방암 종양 면역 미세환경에 대한 단세포 시퀀싱 분석을 기념하여 유방암의 면역지도를 생성하였으며, T세포 활성화와 분화의 다양한 단계를 반영하였다.

그림 2. 단세포 RNA 시퀀싱의 기술적 경로[1]

왜 단세포 시퀀싱으로 암을 연구합니까?

암세포의 유전적 이질성을 포착하기 위해서는 종양조직에서 채취한 대량의 DNA를 심층적으로 분석해야 합니다.이러한 방법은 세 가지 요소에 의존한다:[2]

❖게놈 DNA를 순수화하기에 충분한 재료 (조직 또는 세포) 가 2 세대 시퀀싱 (NGS) 문고제비의 요구 사항을 충족한다.

❖표본에 존재하는 비율이 충분히 높은 클론(clone)과 아클론(subclone) 체세포 돌연변이는 검출 신호로 삼을 수 있다.

❖심층 시퀀싱을 수행하고 이러한 신호를 분석 할 수있는 능력이 있다.

그러나 일부 원발성 종양은 생검이 어려우므로 임상의는 통상 천자(fine-needle aspiration, FNA)를 통해 암의 재료를 추출하여 조직병리학적 검사와 진단이 필요한다. 그러나 FNA 가 항상 깊이 시퀀싱(sequencing)에 충분한 재료를 생산할 수 있는 것은 아니다. 따라서 단세포 시퀀싱(Single-cell sequencing)은 이런 종양을 분석하는 데 도움이 될 것이다.

또한, 깊은 배치 시퀀싱 데이터에서 컨볼 루션 클론(clone)과 아클론(subclone)  세포 돌연변이를 제거하려면 데이터에서 돌연변이 된 DNA 분자를 정확하게 검출해야한다. 또 일부 종양은 간질침윤(intercelluar substance)(예: 췌장암) 때문에 암세포가 시료의 일부만 차지하고 나머지는 간질(intercelluar substance)성분으로 구성될 수 있다.

종양의 대량 게놈과 전사체 연구는 암의 게놈 복잡성을 밝히는 데 도움이 될 것이며, 단세포 시퀀싱 기술은 종양 내의 유전과 전사체 이질성을 해부할 수 있는 강력한 도구를 제공한다.

단세포 시퀀싱의 선진 기술

단세포 시퀀싱에는 어떤 제한이 있습니까?

비록 단세포 시퀀싱 방법을 개발하여 큰 진전을 이뤘지만 여전히 매우 큰 한계가 있다. DNA의 경우, 전유전체증폭(whole-genome amplification, WGA)과 관련된 문제, 예를 들어 대립유전자(Allele)의 손실(즉, 2배체 단세포 게놈의 임의의 특정 유전자의 임의의 두 대립유전자Allele의 랜덤, 우선증폭 및 시퀀싱), 유전체 커버리지가 낮고 DNA 분자를 계수할 수 있는 방법이 부족하기 때문에(특히 다배체 암 게놈의 경우)에 대한 식별에 크게 기여할 수 있다. 또한 핵산 고유의 화학적 불안정성(예를 들어 사이토신Cytosine 염기의 탈아미노화 작용)과 단세포 DNA 증폭에 사용되는 중합효소와 관련된 내재적 오류율은 시퀀싱의 복잡성을 더욱 증가시킨다.

RNA의 경우 데이터 희소, 샘플링 편차, 낮은 수준의 전사본 유전자의 발현 손실로 인해 관찰된 단세포 데이터의 변이를 기술편차로 볼지 생물학적 변이로 볼지가 어렵다. 이러한 문제는 주로 단세포 전사체 방법 중 mRNA 포획의 상대적 비효율에서 기인하며, 그 포획 효율은 5%에서 15% 사이이다.[2]

단세포 시퀀싱의 응용

단세포 시퀀싱은 암의 발달 단계별 유전학과 생물학 연구에 사용될 수 있다. 예를 들어 기원세포 (암능력을 가진 cells subpopulations), 전암 병변, 원위암, 암 전이 등의 연구 등이 있다. 종양조직 내의 세포는 서로 다른 유전과 표현형 특징을 가지고 있으며 종양세포의 이질성을 측정하여 종양세포와 종양미세환경의 세포지도를 그린다. 종양 조직 내의 세포군을 더욱 명확히 하고 특이성 표지물를 찾아 종양 발생, 전이 등의 일련의 문제를 설명한다.

그림 3. 헤마톡실린-에오신(H&E) 염색과 결장장선암 발전의 다른 단계의 모식도 및 단세포 시퀀싱의 각 단계의 응용.[1]

CAR-T 세포요법에서의 단세포 시퀀싱 응용

CAR-T 세포요법은 혈액종양 치료에 큰 진전을 보이고 있으며, 현재 8개의 CAR-T 제품이 출시되고 있으며, 이 중 CD19 항원에 6개, BCMA 항원에 2개가 있다. 하지만 CAR-T 치료는 신경독성을 비롯한 다양한 부작용을 일으킬 수 있다. 신경독성 발생의 기전은 아직 분명하지 않다. 스탠퍼드대 출신의 Kevin R. Parker와 Denis Migliorini 등은 단세포 시퀀싱을 이용해 사람의 뇌벽세포에서 CD19 항원을 발현하는 것을 발견하고 CAR-T세포의 벽세포에 대한 'On-target, off-tumor' 공격이 신경독성의 잠재적 원인일 수 있다고 추정했다.[3]

이 연구는 먼저 scRNA-Seq 데이터 세트를 분석해 인체의 CD19 양성세포를 감정한 결과, CD19 가 인뇌벽세포에서 고도로 표현된 것을 발견했다.

그림 4. CD19는 뇌주변 세포에서 특이적으로 발현된다.[3]

연구팀은 이어 생쥐 모델에서 신경독성 분석을 실시했다. C57BL/6J 생쥐의 뇌 조직에서 CD19 양성 세포가 발견됐다. 연구팀은 또 B세포 표현 CD19 항원이 실험 결과에 미치는 영향을 피하기 위해 중증면역결핍 마우스(NSG 마우스, B세포 없음)를 이용해 분석 실험을 하고 CAR-T세포를 구축해 신경독성을 검증했다. 그 결과 표적쥐원 CD19 를 겨냥한 CAR-T 세포는 혈뇌 장벽 투과성 증가를 초래하고, 인간 CD19 를 겨냥한 CAR-T 세포는 이런 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다.

쥐의 뇌주피 세포(pericyte)와 인간 뇌주피 세포의 단세포 시퀀싱을 비교한 결과, 쥐 뇌주피 세포 중 CD19 의 표현량이 인간 뇌보다 낮고, 쥐 세포 유형과 전사 상태의 종 특이성 차이가 인간 이성 병리 생리학과 정확히 일치하지 않을 수 있다는 사실이 밝혀졌다. 보도에 따르면 최초 마우스 모델에서 진행된 CAR-T 세포 연구는 이후 인체 임상시험에서 관찰된 신경독성의 정도를 예측하지 못했다.[4]

따라서 Kevin R. Parker와 Denis Migliorini니 등이 scRNA-seq 기술을 이용해 해당 항원의 표현을 분석하는 것은 CAR-T 세포 연구에 매우 중요한다. scRNA-seq는 희귀한 세포군을 포획할 수 있으며, 그 측정 지표는 표적치료의 임상효과에서 매우 중요할 수 있으며, 향후 CAR-T세포의 기능이 점점 강해져 여러 표적항원의 조합을 식별할 수 있으며, 점점 더 많은 고형종 연구에 응용될 것이다. 고형종은 정상조직과 대다수 항원을 공유하기 때문에 단세포 시퀀싱은 효율적인 특이성의 표적을 발견하고 설계하는 데 사용할 수 있으며 면역요법 연구의 유력한 도구가 된다.

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 참고 문헌：

[1] Azizi, E., Carr, A. J., Plitas, G., Cornish, A. E., Konopacki, C., Prabhakaran, S., ... & Pe’er, D. (2018). Single-cell map of diverse immune phenotypes in the breast tumor microenvironment. Cell, 174(5), 1293-1308.

[2] Baslan, T., & Hicks, J. (2017). Unravelling biology and shifting paradigms in cancer with single-cell sequencing. Nature Reviews Cancer, 17(9), 557-569.

[3] Parker, K. R., Migliorini, D., Perkey, E., Yost, K. E., Bhaduri, A., Bagga, P., ... & Satpathy, A. T. (2020). Single-cell analyses identify brain mural cells expressing CD19 as potential off-tumor targets for CAR-T immunotherapies. Cell, 183(1), 126-142.

[4] Giavridis, T., van der Stegen, S. J., Eyquem, J., Hamieh, M., Piersigilli, A., & Sadelain, M. (2018). CAR T cell–induced cytokine release syndrome is mediated by macrophages and abated by IL-1 blockade. Nature medicine, 24(6), 731-738.

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https://apac.cyagen.com/community/technical-bulletin/single-cell-sequencing-tumor-immunity.html