인간화 모델은 질병 연구의 핵심 퍼즐 조각일까요? 다양한 부위의 돌연변이 질병 유발 연구에 대한 이해 [희귀병의 열 가지 죄 8]

【희귀병의 열 가지 죄】특집에서 희귀병의 발생, 발전 메커니즘, 산업 연구 진전(유전자 치료 등), 성과를 임상 전 단계로 전환하는 혁신 전략(모델 구축 및 약물 스크리닝 등)을 소개합니다. 지난 회 되돌아보기:

♦근이영양증 '사천왕' 관련 질환에 관한 연구 [희귀병 10종죄 4]

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♦엔젤만 증후군(Angelman syndrome, AS)'에 대해 더 깊이 탐구하고 '행복한 인형' 뒤에 가려진 모계 유전적 이상 기전을 탐구합니다 [희귀병의 열 가지 죄 7]

유전자 돌연변이란 유전자의 구조에서 염기쌍의 구성이나 배열 순서의 변화가 일어나는 것을 말합니다. 이는 코딩 영역뿐만 아니라 프로모터, 인트론, 절단 부위 등 디코딩 영역에서도 일어날 수 있으며, 이는 곧 어디서든 돌연변이의 위험 지대를 밟을 수 있어 다양한 질병 위험을 유발할 수 있습니다. 이번 호에서는 각종 유전자 서열의 특정 위치에서 발생하는 다양한 유전자의 주요 병원성 돌연변이를 살펴봅시다. 예:

➢ ELP1 유전자의 인트론 부위 돌연변이 IVS20+6T>C가 발생하여 가족성 자율신경 기능 이상 증상(Familial Autonomic Dysfunction)을 유발합니다.

➢ DMPK 유전자3' 비전환 영역에서 불안정한 CTG 반복 단편이 비정상적으로 발생되어 근긴장성 이영양증(Myotonic Dystrophy)을 일으킵니다.

➢ DUX4 프로모터 근처 지역의 비정상적인 메틸화가 발생하여 안면견갑상완 근이영양증(FSHD, Facioscapulohumeral Muscular Dystrophy)을 초래합니다.

가족성 자율신경 기능 이상 증상

가족성 자율신경 실조증후군(Familial dysautonomia syndrome, FD)은 보기 드문 가족성 상염색체 열성 유전 질환으로 주로 신경 기능 장애와 특히 자율신경 실조를 특징으로 하는 일련의 임상 증상을 나타냅니다. 이 질병은 릴리-데이증후군(Riley-Day syndrome), 가족성 자율 신경 기능부전증, 중추성 자율 신경 부전 증후군 등이라고도 합니다.

FD 환자의 9% 이상의 ELP1 유전자의 20-인트론에서 IVS20+6T>C 돌연변이가 발견되었으며 이러한 돌연변이는 U1 소핵 리보스 핵단백질을 파괴하여 인트론 20의 주요 스플라이싱 부위 간의 염기쌍 결합을 파괴하여 엑손 20의 코딩 서열 이탈을 유발합니다. 이러한 잘못된 스플라이싱은 전사체에 프레임 시프트를 일으키고 결과적으로 mRNA는 79kDa의 단축된 단백질을 생성합니다[1-2].

인간 세포의 스플라이싱 과정을 마우스 모델을 사용하여 연구하는 것은 두 종 사이의 스플라이싱 과정 차이 때문에 어려움이 있으며[3], 특히 이 인트론 부위 돌연변이로 인한 질병 연구는 더욱 그렇습니다. 기존 문헌에 따르면 이 유전자를 순수하게 녹아웃하면 배아 치사를 유발하며 야생형 마우스에서 인간화 돌연변이 유전자를 직접 발현하는 경우, 정상적인 내재적 마우스 ELP1의 발현으로 인해 뚜렷한 질병 표현형이 나타나지 않을 수 있습니다[4-6]. 이에 따라 Cyagen은 ELP1 전체 게놈 인간화 마우스와 이를 기반으로 한 핫스팟 돌연변이 인간화 유전자 전환 질병 모델을 독자적으로 개발했습니다.

안면견갑상완 근이영양증

안면견갑상완 근이영양증(Facioscapulohumeral muscular dystrophy, FSHD)은 상염색체 우성 유전으로 발생하는 가장 흔한 근이영양증 중 하나입니다. 이 질병은 진행성이며 비대칭적(혹은 대칭적)인 근무력증 및 근위축을 주요 증상으로 나타냅니다. 비록 병의 진행은 상대적으로 느리지만 장애율이 높으며 약 20%의 환자들이 휠체어에 의존하게 되며 삶의 질에 심각한 영향을 미칩니다.

임상적으로 FSHD는 FSHD1과 FSHD2의 두 가지 유형으로 나뉘는데 두 유형의 발병 메커니즘이 다르지만 최종 결과는 모두 메틸화 수준이 감소하여 DUX4(double homeo-box4)를 초래해 유전자가 골격근에서 비정상적으로 발현되거나 DUX4 단백질 기능 이상을 초래합니다[7]. DUX4는 일종의 독성 전사 인자로 수 백 개의 하류 유전자를 활성화하고 근육 발달을 저해하며 면역 반응을 활성화하고 산화 스트레스 민감도를 높여 궁극적으로 세포 사멸 경로를 활성화합니다.

현재 이 질병의 임상 전 파이프라인 연구에는 FLExDUX4 마우스 모델을 사용합니다[8]. 이는 일종의 유도 모델로 구축이 복잡하며 초기 모델은 AAV를 통해 DUX4를 전달하여 질병 모델을 구축하였습니다[9]. 이에 대응하여 Cyagen은 차세대 AAV를 통한 DUX4 질병 모델을 독자적으로 연구개발했으며, 이는 몇 주 이내에 빠르게 구축이 가능하고 질병의 임상 전 연구에 사용될 수 있습니다.

위축성 근강직

위축성 근강직은 ‘근긴장성 이영양증(Myotonic dystrophies, DMs)’이라고도 하는데 이는 상염색체 우성 유전 희귀 질환으로 돌연변이 외현률이 높고 가족 내 집중적으로 발생하는 경향이 있습니다. 이 질환은 고도의 임상적 이질성을 보이며 주요 증상으로는 근강직, 근무력, 근위축 등이 있습니다. DMs는 근긴장성 이영양증 I형(Dystrophia myotonica 1, DM1)과 근긴장성 이영양증 II형(Dystrophia myotonica 2, DM2)의 두 가지 유형으로 나뉩니다. 그중 DM1이 대부분을 차지하며 DMPK 유전자 3'의 비번역 구역에서 불안정한 CTG 중복 단편의 비정상적인 증폭으로 인해 초래된 것입니다[10].

정상인은 5-37개의 CTG 복제본을 포함하고 있지만 DM1 환자의 경우 이 복제본 수는 50에서 수천 개로 증가될 수 있습니다. 일반적으로 CTG의 중복 수가 37개를 초과하면 불안정해져 유사 분열이나 감수 분열 과정에서 쉽게 증폭됩니다. 돌연변이의 DMPK 전사본이 세포핵 안에 막혀 분산된 응집 병소를 형성하고 세포 발육을 유지하는 데 필요한 단백질의 정상적인 기능에 영향을 미쳐 독성 작용을 일르킨다는 증거가 날로 증가하고 있습니다. 현재 연구에 사용되는 질병 모델은 DMPK 유전자 변형(여러 CTG 중복 포함)[11] 및 HSALR 유전자 변형 마우스 모델[12]을 위주로 하며 Cyagen은 이 두 가지 유전자 변형 모델을 독립적으로 구축하여 DM1에 대한 임상 전 연구에 더 나은 모델을 제공합니다.

HUGO-GT^TM 차세대 인간화 마우스 모델 구축 프로젝트

위에서 언급한 질병뿐만 아니라 망막색소변성(Retinitis pigmentosa, RP), 황반 변성(Macular degeneration, AMD), 파킨슨병(Parkinson's disease, PD) 등 다양한 질병 유형에 대한 병원성 메커니즘을 깊이 연구하려면 긴 단편 또는 차세대 인간화 마우스 모델이 보다 더 나은 선택일 수 있습니다. 그러나 전체 게놈을 대체하는 기술적 어려움이 크고 대규모로 도입된 외래 서열이 기존 유전자 발현 조절을 교란시킬 수도 있습니다.

이를 위해 Cyagen 바이오는 HUGO-GT^TM 프로그램을 시작하여, 자체 개발한 TurboKnockout-Pro 기술을 기반으로 마우스 유전자를 제자리에서 교체하여 더 풍부한 개입 표적을 포함하는 전체 게놈 인간화 마우스를 성공적으로 구축하였습니다. HUGO^TM 마우스는 보다 더 효율적인 큰 단위의 융합 기술을 이용하여 어떤 경우에도 적용될 수 있는 템플릿으로서 현실 세계 바이오 메커니즘으로 사용할 수 있으며 현실 세계 생물 메커니즘에 더 가깝게 만드는 약물 임상 연구 모델을 탑재하였습니다.

비고: HUGO-GT는 Humanized Genomic Ortholog for Gene Therapy의 약자입니다.

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➢더 많은 추천

참고 문헌:

[1]Carmel I , Tal S , Vig I ,et al.Comparative analysis detects dependencies among the 5′ splice-site positions[J].RNA, 2004, 10(5):828-840.DOI:10.1261/rna.5196404.

[2]Anderson S L , Coli R , Daly I W ,et al.Familial Dysautonomia Is Caused by Mutations of the IKAP Gene[J].The American Journal of Human Genetics, 2001, 68(3):753-758.DOI:10.1086/318808.

[3]Pan Q , Bakowski M A , Morris Q ,et al.Alternative splicing of conserved exons is frequently species-specific in human and mouse.[J].Trends in Genetics, 2005, 21(2):73-77.DOI:10.1016/j.tig.2004.12.004.

[4]Hims M M , Shetty R S , Pickel J ,et al.A humanized IKBKAP transgenic mouse models a tissue-specific human splicing defect.[J].Genomics, 2007, 90(3):389-396.DOI:10.1016/j.ygeno.2007.05.012.

[5]Chen Y T , Hims M M , Shetty R S ,et al.Loss of Mouse Ikbkap, a Subunit of Elongator, Leads to Transcriptional Deficits and Embryonic Lethality That Can Be Rescued by Human IKBKAP[J].Molecular and Cellular Biology, 2009, 29(3):736-744.DOI:10.1128/MCB.01313-08.

[6]Dietrich P , Yue J , Shuyu E ,et al.Deletion of Exon 20 of the Familial Dysautonomia Gene Ikbkap in Mice Causes Developmental Delay, Cardiovascular Defects, and Early Embryonic Lethality[J].Plos One, 2011, 6(10):e27015.DOI:10.1371/journal.pone.0027015.

[7]Ansseau Eugénie,Vanderplanck Céline, Armelle W ,et al.Antisense Oligonucleotides Used to Target the DUX4 mRNA as Therapeutic Approaches in FaciosScapuloHumeral Muscular Dystrophy (FSHD)[J].Genes, 2017, 8(3):93.DOI:10.3390/genes8030093.

[8]Lim K R Q , Maruyama R , Echigoya Y ,et al.Inhibition of DUX4 expression with antisense LNA gapmers as a therapy for facioscapulohumeral muscular dystrophy (vol 117, pg 16509, 2020)[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America.  2020(35):117.

[9]Ba L M W , Garwick S E , Mei W ,et al.DUX4, a candidate gene for facioscapulohumeral muscular dystrophy, causes p53-dependent myopathy in vivo.[J].Annals of Neurology, 2011, 69(3):540-552.DOI:10.1002/ana.22275.

[10]Yin Q , Wang H , Li N ,et al.Dosage effect of multiple genes accounts for multisystem disorder of myotonic dystrophy type 1[J].Cell Research, 2019, 30(2):1-13.DOI:10.1038/s41422-019-0264-2.

[11]Mahadevan M S , Yadava R S , Yu Q ,et al.Reversible model of RNA toxicity and cardiac conduction defects in myotonic dystrophy.[J].Nature Genetics, 2006, 38(9):1066.DOI:10.1038/ng1857.

[12]Mankodi A, Logigian E, Callahan L, McClain C, White R, Henderson D, Krym M, Thornton CA. Myotonic dystrophy in transgenic mice expressing an expanded CUG repeat. Science. 2000 Sep 8;289(5485):1769-73. doi: 10.1126/science.289.5485.1769. PMID: 10976074.