근이영양증 '사천왕' 관련 질환에 관한 연구 [희귀병 10종죄 4]

‘희귀병 10종죄 4' 칼럼에 들어가 희귀질환의 발생 및 발달 메커니즘, 산업 연구 진행 상황(유전자 치료 등), 결과의 전환을 촉진하기 위한 전임상 혁신 전략(모델 구축 및 약물 스크리닝 등)을 해독합니다.

이전 회고:

1. RHO 및 관련 병원성 메커니즘은 무엇입니까? RHO 유전자 치료의 연구 진행 상황은 어떻습니까?

2. 희귀병의 열 가지 죄2: 왜 차세대 인간화 마우스 모델이 ‘남성이 많고 여성이 적은’ 혈우병 연구에 더 효과적인지 원인 분석

3. 루게릭병 ALS와 밀접한 관계가 있는 발병 유전자 TARDBP는 과연 천사인가 악마인가? 【희귀병의 열 가지 죄 3】

근이영양증(Muscular Dystrophy)

이번 호에서 우리가 주목해야 할 것은 근영양불량증이다. 이는 성악화를 일으키는 근력력증과 운동을 지배하는 근육변성을 특징으로 하는 유전성 질병군을 가리킨다. 얼마 전 DMD치료에 사용된 최초의 유전자 요법으로 신약 SRP-9001 이 FDA 가속 승인을 받았다는 소식은 지속적인 관심을 받고 있다. 여기서 듀켄씨근이영양증(Duchenne muscular dystrophy, DMD) 은 근이영양증 중 하나다.

DMD 외에도 muscular dystrophy 의 관심도가 높은 유형에는 Facioscapulohumeral muscular dystrophy, Myotonic dystrophy, Limb-girdle muscular dystrophy 가 있다. 다음으로, 우리는 병원성 기전과 유전자 치료 측면에서 근이영양증(Muscular Dystrophy)의 '4대 천왕'을 살펴봅니다.

DMD의 병원 메커니즘 및 유전자 치료

DMD의 병원성 유전자는 인간의 정상적인 근육 구조와 기능에 필수적인 항근위축 단백질(dystrophin)을 생성하는 유전자를 코딩하는 매우 명확합니다. DMD 환자의 DMD 유전자는 돌연변이를 일으키는데, 주로 유전자 부족을 위주로 DMD 가 제대로 표현되지 않고 기능을 발휘하지 못하게 한다.

현재 DMD 에 대한 유전자 치료의 주요 유형은 CRISPR, ASO, AAV 등이다. 관련 독서: DMD 대표 유전자 요법 및 관련 모델. 특히 CRISPR, ASO 유전자 요법 [1] 의 경우 약물은 인간 핵산 서열의 편집과 관련이 있기 때문에 인간 핵산 서열과 더 일치하는 동물 모델이 필요하지만, 비인간 영장류의 가격이 비싸기 때문에 전체 게놈 인간화 쥐는 더 효율적이고 특이한 유전자 치료 관련 약물의 임상 전 실험동물이 되었다.

이를 위해 Cyagen는 DMD 유전자의 핫스팟 돌연변이 영역과 약물 표적 영역을 포함하는 여러 hDMD 모델을 독자적으로 개발했습니다. 인기 지역의 야생형 인간화 모델 외에도 이를 기반으로 인기 있는 점 돌연변이 인간화 모델을 수정하여 보다 이상적인 인간화 대조군과 질병 모델을 동시에 제공할 수 있습니다.

Cyagen은 DMD의 기본 인간화 품계 및 점 돌연변이 모델에 대해 다음과 같이 설명합니다.

➢핫스팟 돌연변이 영역을 가진 야생형 및 이를 기반으로 구축된 점 돌연변이 인간화 질병 모델.

➢기존 야생형 인간화에 직접 다른 점 돌연변이를 사용자 정의하여 효율성과 성공률을 높일 수 있습니다.

➢인간화 영역은 대부분의 약물 표적 영역을 포함하며 약물 스크리닝 및 약효 연구에 더 적합하며 특히 ASO, CRISPR, siRNA 및 기타 유전자 치료 관련 약물에 더 적합합니다.

➢인간 DMD 유전자는 제자리에 삽입되고 복제 수가 결정되며 안정적으로 유전될 수 있습니다.

FSHD의 병원 메커니즘 및 유전자 치료

FSHD 는 FSHD1 과 FSHD2 의 두 가지 유형으로 나뉩니다. 발병 메커니즘은 다르지만 최종 결과는 DUX4(Double homeo-box 4) 유전자가 골격근에서 비정상적으로 발현되거나 DUX4 단백질 기능이 비정상입니다. 환자의 95%가 1형이고 FSHD1형의 병원성 원인은 주로 4번 염색체의 장완 subtelomere 구 내 D4Z4 위성의 직렬 반복 서열의 다중 복사 결실과 관련이 있으며, 이는 DUX4 유전자의 메틸화 정도를 감소시켜 골격근에서 재발현을 억제하고 질병을 유발합니다.

유전자 치료는 주로 ASO 와 siRNA 를 통해 독단백질 DUX4 표현을 억제하는 것을 위주로 하며, 사용되는 모델은 FLExDUX4 마우스 (유도형) [3] 와 주사 AAV 를 통해 DUX4 마우스 [4] 의 두 가지 종류가 있다. Cyagen는 유전자 치료제의 전임상 연구에 더 잘 사용될 수 있는 DUX4 발현 AAV 마우스 모델을 독자적으로 개발했습니다.

DM의 병원 메커니즘 및 유전자 치료

DM은 DM1과 DM2의 두 가지 유형으로 나뉘며 그 중 DM1이 대다수를 차지하며 병원성 기전은 DMPK 유전자의 3' 비번역 영역에서 불안정한 CTG 반복 단편의 비정상적인 증폭으로 인해 RNA 결합 단백질의 조절 장애와 mRNA의 비정상적인 스플라이싱을 유발하여 이에 따라 다양한 조직 결함을 유발하고 DM 다중 시스템에 장애가 발생합니다. 유전자 치료는 주로 ASO 및 siRNA에 의한 DMPK 발현 억제에 중점을 두고 있으며, 사용된 모델은 주로 DMPK 형질전환(여러 CTG 반복 포함)[5] 및 HSALR 형질전환 마우스[6]이며, Cyagen는 DM1의 전임상 연구에 적용할 수 있는 이 두 가지 유전자 변형 모델을 독자적으로 구축했습니다.

LGMD의 병원성 기전 및 유전자 치료

LGMD 는 팔다리 지역이나 어깨와 엉덩이 주위의 근육 위축을 주요 증상으로 하는 신경근육질환의 총칭으로, 일반적으로 LGMD 를 상염색체 우성 유전자 1 형과 상염색 열성 유전자 2 형으로 분류한다. 병원성 유전자의 대부분은 주로 DYSF, SCGA, SGCB 등 근육 기능성 단백질의 생산에 영향을 미치는 유전자 돌연변이와 관련이 있습니다. 유전자 치료는 주로 AAV 전달 요법을 통해 결실 단백질을 보충하여 치료되며 물론 문헌에 ASO 점프 요법에 대한 연구도 있습니다.병원성 기전과 유전자 요법을 기반으로 사이업바이오는 hDYSF(WT, MU), Dysf-KO, Scgs-KO, Sgcb-KO 등[7] 마우스 모델을 독자적으로 개발하여 LGMD 질환의 전임상 약물 개발을 돕습니다.

HUGO-GT^TM 전유전체 인간화 모델 구축

근이영양증뿐만 아니라 망막색소변성(RP), 황반변성(AMD), 파킨슨병(PD) 등 다양한 질병 유형에 대해 병원성 기전에 대한 심층 연구를 수행하려면 긴 단편 또는 전체 게놈 인간 생쥐가 더 나은 선택입니다.그러나 전체 게놈 교체에 필요한 기술적 어려움이 높으며 대규모로 도입된 외인성 서열은 원래 유전자의 발현 조절에 영향을 미칠 수 있습니다.

이를 위해 Cyagen는 HUGO-GT^TM 프로그램을 시작했으며, 자체 개발한 TurboKnockout-Pro 기술을 기반으로 마우스 유래 유전자를 제자리에서 교체하여 더 풍부한 개입 표적을 포함하는 전체 게놈 인간 마우스를 성공적으로 구성했습니다. HUGO-GT^TM 마우스는 보다 효율적인 대용량 벡터 융합 기술을 탑재하여 표적 돌연변이 맞춤형 서비스를 위한 만능 템플릿으로 사용할 수 있으며 실제 생물학적 메커니즘에 더 가까운 약물 전임상 연구 모델입니다.

설명：HUGO-GT^TM ( Humanized Genomic Ortholog for Gene Therapy)

참고 문헌:

[1] Lee T , Awano H , Yagi M ,et al.2′-O-Methyl RNA/Ethylene-Bridged Nucleic Acid Chimera Antisense Oligonucleotides to Induce Dystrophin Exon 45 Skipping[J].Genes, 2017, 8(2):67.DOI:10.3390/genes8020067.

[2] Lim K R Q , Maruyama R , Echigoya Y ,et al.Inhibition of DUX4 expression with antisense LNA gapmers as a therapy for facioscapulohumeral muscular dystrophy (vol 117, pg 16509, 2020)[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America.  2020(35):117.

[3] Jones T I , Chew G L , Barraza-Flores P ,et al.transgenic mice expressing tunable levels of dux4 develop characteristic facioscapulohumeral muscular dystrophy-like pathophysiology ranging in severity title: fshd-like transgenic mouse models of varying severity[J].  2019.DOI:10.1371/journal.pone.0150938.

[4] Ba L M W , Garwick S E , Mei W ,et al.DUX4, a candidate gene for facioscapulohumeral muscular dystrophy, causes p53-dependent myopathy in vivo.[J].Annals of Neurology, 2011, 69(3):540-552.DOI:10.1002/ana.22275.

[5] Mahadevan M S , Yadava R S , Yu Q ,et al.Reversible model of RNA toxicity and cardiac conduction defects in myotonic dystrophy.[J].Nature Genetics, 2006, 38(9):1066.DOI:10.1038/ng1857.

[6]Mankodi A, Logigian E, Callahan L, McClain C, White R, Henderson D, Krym M, Thornton CA. Myotonic dystrophy in transgenic mice expressing an expanded CUG repeat. Science. 2000 Sep 8;289(5485):1769-73. doi: 10.1126/science.289.5485.1769. PMID: 10976074.

[7]Jakub,Malcher,Leonie,et al.Exon Skipping in a Dysf-Missense Mutant Mouse Model.[J].Molecular Therapy Nucleic Acids, 2018.DOI:10.1016/j.omtn.2018.08.013.