HFD+CCl4-Induced 대사이상 지방간염(MASH/NASH) 마우스 모델

이전에 비알코올성 지방간염(Nonalcoholic steatohepatitis, NASH)으로 알려진 대사이상 지방간염(Metabolic dysfunction-associated steatohepatitis, MASH)은 만성 간 질환입니다. 이 질환은 비만이나 당뇨병과 같은 대사 이상에서 흔히 발생하며, 지방이 간에 축적되어 독성을 유발하고 염증을 일으킬 수 있습니다. 이러한 염증이 섬유증과 결합하면 간경변(cirrhosis)이나 간세포암(Hepatocellular carcinomam, HCC)으로 진행될 수 있습니다. MASH는 이전에 비알코올성 지방간 질환(Nonalcoholic fatty liver disease, NAFLD)으로 불렸던 대사이상 관련 지방성 간질환(Metabolic dysfunction-associated steatotic liver disease, MASLD)의 범주 내에서 가장 심각한 증상을 나타냅니다. ^[1]

이 연구의 목적은 섬유증 특성을 가진 MASH (NASH) 동물 모델을 개발하여 전임상 요구를 충족시키는 것입니다. Cyagen은 최초 FDA 승인을 받은 MASH 약물인 Rezdiffra (resmetirom)를 사용하여 MASH 동물 모델의 치료 효능을 평가합니다.

복합 MASH 마우스 모델 연구 방법

40마리의 C57BL/6J 마우스(4~5주, 수컷) 모델을 받아 12시간의 표준  light/dark cycle(오후 7시에 소등)에 따라 길렀습니다. 35마리의 마우스 모델에는 고지방식이(High fat diet, HFD; D12492, 60%kcal from fat)를 먹였고, 나머지 5마리의 마우스 모델에는 정상식이(Chow diet)를 12주 동안 먹였습니다. 사염화탄소(CCl4)는 간 손상을 유발할 수 있으며 단독으로 투여하거나 고지방 식이와 함께 투여하여 지방간 또는 간 섬유화를 유도하는 방법으로, 유도 기간이 비교적 짧습니다.

실험을 시작할 때 마우스 모델을 무작위 배정하여 4개 그룹으로 나누었습니다: 그룹 1, 정상식이(Chow diet) 대조군(n=5); 그룹 2, 고지방식이(HFD) 대조군(n=5); 그룹 3, HFD+사염화탄소(CCL4)(n=5); 그룹 4, HFD+CCL4+레스메티롬(Resmetirom) 1일 3 mg/kg 경구 투여 (n=5). 치료는 고지방식이(HFD) 12주 후인 13주 차에 시작하여 4주 동안 지속되었습니다. 치료 기간 매일 한 번씩 체중을 측정했습니다. 치료 후 모든 마우스 모델을 안락사 시켰고, 추가 검증을 위해 혈액과 간을 채취했습니다.

그림 1. 복합 MASH 마우스 모델 실험의 연구 개요

HFD+CCl4-Induced MASH (NASH) 마우스 모델의 효능 데이터

그림 2. Resmetirom이 체중 및 간 무게에 미치는 영향

(A) Intervention 기간의 체중 변화, (B) Endpoint의 간 무게. *P <0.05, HFD 대조군과 유의하게 다릅니다. 데이터는 Mean±SEM으로 표시되며, 그룹당 n = 5입니다. 일원 분산분석(One-way ANOVA)에 의해 p <0.05의 수치를 통계적으로 유의미한 것으로 간주하였습니다.

그림 3. Resmetirom이 혈청 TC, HDL-C 및 LDL-C 수치를 개선했습니다.

(A) 총콜레스테롤(TC) 수치, (B) 고밀도 지단백 콜레스테롤(HDL-C) 수치, (C) 저밀도 지단백 콜레스테롤(LDL-C) 수치. 데이터는 Mean±SEM으로 표시되며, 그룹당 n=5입니다. WT 그룹과 비교하여 # p < 0.05, ## p < 0.005 및 ####p < 0.001; 일원 분산분석(One-way ANOVA)을 실시한 HFD+CCL4 그룹과 비교하여 * p < 0.05, ** p < 0.005의 결과를 기록했습니다.

그림 4. Resmetirom이 14일째 Endpoint에서 CCL4에 의해 유도된 혈청 ALT 및 AST 수치를 보호했습니다.

(A) ALT(Alanine Aminotransferase) 수치; (B) AST(Aspartate Aminotransferase) 수치. 데이터는 Mean±SEM으로 표시되며, 그룹당 n=5입니다. WT 그룹과 비교하여 # p < 0.05, ## p < 0.005; HFD+CCL4 그룹과 비교, 일원 분산분석(One-way ANOVA)을 실시한 HFD+CCL4 그룹과 비교하여 * p < 0.05, ** p < 0.005의 결과를 기록했습니다.

그림 5. 4주 동안 정상식이(Chow diet), 고지방식이(HFD), CCL4(0.125mL/kg)로 처리한 HFD, CCL4(0.125mL/kg) 및 Resmetirom(3mg/kg)으로 처리한 HFD를 투여한 마우스 모델의 조직병리학

Resmetirom은 간에서 HFD-induced 지방증과 간세포 팽창(Hepatic ballooning)을 보호했습니다. (A) H&E염색의 대표 이미지, (B) ORO 염색의 대표 이미지, (C) PSR 염색의 대표 이미지, (D) NAS 점수. 파란색 화살표는 지방증, 녹색 화살표는 소엽 염증(Lobular inflammation), 검은색 화살표는 그림 A에서 간세포 팽창(Hepatocyte ballooning)을 나타냅니다. 병리학적 점수는 지방증(0-3), 소엽 염증(0-3), 간세포 팽창(0-2), NAS 활성도(0-8)로 나타냅니다. 데이터는 Mean±SEM, 그룹당 n=5로 표시됩니다.

그림 6. Resmetirom은 간 섬유증 marker의 mRNA 수치를 억제했습니다.

(A) 간 α-SMA(Acta2) 발현, (B) 간 콜라겐(Collagen) 1α1 발현의 대표적인 mRNA 수준 및 정량 분석. 데이터는 Mean±SEM, 그룹당 n=5로 표시됩니다. 일원 분산분석(One-way ANOVA)에 의해 p < 0.05, ** p < 0.005, ****p < 0.001의 결과를 기록했습니다.

결론

12주 동안 고지방 식이(HFD)를 먹인 후 DIO 마우스의 체중, 간 무게, 혈청 TC, HDL-C, LDL-C, AST 및 ALT 수치를 증가할 수 있습니다. CCL4는 유도 시간을 단축하고 DIO 마우스 모델에서 간 섬유증을 악화시켜 마우스 모델의 MASH 진행을 가속화하고 악화시킵니다. CCL4로 유도한 마우스 모델은 비만, 지방증 및 섬유증을 발생시켜 MASH의 임상 기준을 충족할 수 있습니다. 이 모델은 제약 산업에서 MASH의 잠재적 신규 약물을 평가하는 데 널리 사용되어 있습니다. Resmetirom으로 치료하면 체중과 간 무게가 유의하게 감소하는 동시에 혈청 TC, HDL-C 및 LDL-C 수치가 감소할 수 있습니다. 또한 Resmetirom은 지방증과 섬유증을 감소시켜 MASH의 DIO+CCL4 복합 마우스 모델에서 그 효능을 보였습니다.

상기 마우스 모델은 대사장애 관련 지방간염 MASH(NASH) 연구에 중요한 도구를 제공하여 질환의 발병 기전에 대한 심층적인 이해를 촉진하고 새로운 치료법 개발의 잠재력을 제공합니다. 또한, Cyagen은 대사 및 심혈관 질환 연구를 위한 다양한 유전자 편집 및 유도 모델을 제공하여 관련 분야 연구자의 실험 요구를 충족합니다.

대사 및 심혈관 질환 연구를 위한 유전자 편집 모델

약물 스크리닝 및 평가를 위한 Cyagen의 마우스 모델 플랫폼은 Ldlr knockout (KO) (em), Lep KO, Uox-KO (Prolonged), Atp7b KO, Foxj1 KO 등 다양한 유전자 편집 마우스 모델을 제공할 수 있습니다.

또한 Cyagen은 비만, 죽상동맥경화증, 제2형 당뇨병, 췌장염 연구를 위한 다양한 대사 질환 동물 모델과 Rat / Mouse 표현형 분석부터 in vivo 약물 효능 평가 서비스까지 포괄적인 전임상 CRO 서비스를 제공합니다. 이러한 종합적인 능력을 바탕으로 Cyagen은 차세대 전임상 질환 연구 및 신약 개발을 간소화하는 것을 목표로 합니다.

대사 및 심혈관 질환 연구를 위한 기타 마우스 모델: Spontaneous, Induced, Composite, & Surgical

참고문헌:

1. Shuang Wang and Scott L. Found in Translation – Fibrosis in Metabolic Dysfunction-Associated Steatohepatitis (MASH). Sci Transl Med. 2023 Oct 4; 15(716).