백혈병 치료 핫한 표적Flt3 유전자

Cyagen은 이번 주 마우스 모델에 대한 이야기를 들려드리니 다양한 마우스 모델에 대해 알아가는 데 도움이 되시길 바랍니다. 오늘 여러분을 만난 것은 Flt3 유전자 편집 마우스입니다.

Flt3 유전자

이 유전자는 조혈 기능을 조절하는 클래스 III 수용체 티로신인산화효소(tyrosine kinase)를 암호화합니다. 이 수용체는 세포외 도메인에 대한 fms 관련 티로신인산화효소3 (tyrosine kinase)리간드의 결합에 의해 활성화되어 원형질막(plasma membrane)에서 동종이량체(homodimeric)의 형성을 유도하여 수용체의 자가인산화를 유도합니다. 활성화된 수용체 키나아제는 그런 다음 골수에서 조혈 세포의 세포자멸사, 증식 및 분화와 관련된 경로에서 여러 세포질 실행기(effector) 를 인산화하고 활성화합니다. 이 유전자와 관련된 질환으로는 백혈병, 급성 골수 백혈병(acute myelogenous leukemia) 등이 있다. 관련 경로에는 ERK 신호 경로와 약동학(Pharmacokinetic) 관련 신호 경로가 포함됩니다.

그림 1. Flt3 단백질 구조 입니다[6].

Flt3 유전자와 백혈병

연구에 따르면 Flt3 유전자 관련 질병에는 백혈병과 급성 골수 백혈병이 있다. 백혈병은 조혈모세포의 악성 클론성 질환이다. 질병의 병원성 요인에는 바이러스 요인(RNA 바이러스), 화학적 요인(벤젠 및 그 유도체, 니트로사민, 페닐부타존(phenylbutazone) 및 그 유도체 및 클로람페니콜 등), 방사선 요인(코발트-60) 및 유전적 요인(염색체 이상) 등이 있다.

이 질병의 발병기전은 대부분 골수 및 기타 조혈 조직에서 클론성 백혈병 세포의 통제되지 않는 증식, 분화 장애, 세포자멸사 장애 등으로 인해 클론성 백혈병 세포가 다른 비조혈 조직 및 기관에 침투하여 정상적인 조혈 기능을 억제한다. 이 질병의 임상 증상은 대부분 빈혈, 출혈, 감염 및 발열, 뼈 통증 및 간, 비장 및 림프절 비대입니다.

급성 골수성 백혈병은 골수 미세환경에 크게 의존하는 파괴적인 질환으로 골수생태위라고도 하는 미토콘드리아 산화적 인산화 시스템에 크게 의존하여 ATP를 생성하는 백혈병의 일종이다. 이 질병에 일반적으로 사용되는 치료법으로는 화학요법, 방사선요법, 표적치료, 면역요법, 줄기세포이식 등이 있으며, 일반적으로 사용되는 치료제로는 Ara-C, 에토포시드(Etoposide), 아드리아마이신(Adriamycin) 등이 있으며, 또한 관련 연구에 따르면 메트포르민(Metformin)은 화학요법의 민감성을 감소시키는 데 잠재적인 가치가 있다[1~3].

Flt3 유전자 편집 마우스

1.점 돌연변이 마우스

Bailey E 등의 연구에 따르면 Flt3 유전자의 돌연변이는 급성 골수성 백혈병을 유발할 수 있다 [4]. 이 질병의 가장 흔한 Flt3 돌연변이는 근막 도메인(Proximal membrane domain)의 내부 직렬 반복(ITD) 돌연변이(23%)와 티로신인산화효소(tyrosine kinase) 도메인의 점 돌연변이(10%)입니다. 연구원들은 838번 아스파르트산(aspartic acid) (835번 인간 아스파르트산 잔기에 해당)을 티로신(FLT3/D835Y)으로 대체하여 FLT3/D835Y 돌연변이 쥐를 생성했으며 FLT3/ITD 돌연변이 쥐와 비교하여 FLT3/D835Y 쥐가 더 오래 생존함을 발견했다.

생후 12주에 이형접합 FLT3/D835Y 생쥐는 비장이 부어오르지만 FLT3/ITD 생쥐에 비해 붓기가 적다. FLT3/D835Y 및 FLT3/ITD 생쥐 골수(BM)의 Mac1+, Gr1+ 및 Mac1+/Gr+의 세포 비율은 WT 생쥐보다 높았다. 3개월령과 12개월령 생쥐 BM과 비장조직학을 비교한 결과 FLT3/D835Y와 FLT3/ITD 생쥐 BM과 비장조직구조가 파괴되고 세포가 확장되는 것으로 나타났으며 FLT3/ITD 생쥐에 비해 FLT3/D835Y 생쥐는 병변이 더 가볍다. FLT3/ITD 생쥐와 비교하여 FLT3/D835Y 생쥐는 골수 증식성 종양 침습성이 낮고 B 세포 발달에서 차단 효과가 적다(그림 2).

그림 2. Flt3 유전자 돌연변이 표현형이다[4].

비고: (A): 야생형 및 FLT3/ITD 생쥐와 비교하여 12주령 FLT3/D835Y 생쥐의 비장 크기는 보통입니다. (B)12주령 야생형, FLT3/D835Y 및 FLT3/ITD 마우스 BM에서 Mac1 및 Gr1 발현의 대표적인 FACS 분석 및 그래픽 표현입니다. (C)3개월 및 12개월에 세 가지 유전자형 모두에서 BM 및 비장의 H&E 염색(축척, 100μm)을 수행했습니다. (D) 면역표현형 분석은 12주령 생쥐 BM의 B 림프구 관련 마커를 사용하여 수행되었습니다. (E) D에서 평가된 바와 같이 B 세포 발달의 다양한 단계에서 세포 빈도를 그래픽으로 나타내며 데이터는 3개의 개별 실험(각 실험 n=3)을 나타냅니다. (F)세 가지 마우스 모두의 B220+CD43+CD19 세포에서 전사 인자의 발현 수준은 정량적 RT-PCR에 의해 평가되었습니다.데이터는 평균 ± SEM으로 표시되며 그래프의 P 값은 NS, P＞0.05; *P＜0.05; **P＜0.001입니다.

2. 조건부 녹아웃 마우스

Zriwil A 등연구자들은 Flt3 유전자 15번 엑손에 loxP-Neo-loxP를 삽입하여 Mx1cre/+와 교배를 통해 림프조상세포(Myeloid progenitor) Flt3 녹아웃 쥐를 생산한다[5].

Mx1cre/+ Flt3fl/fl 및 Mx1+/+ Flt3fl/fl 마우스에 2일 간격으로 300㎍의 폴리리보시티딜산polyribocytidylic acid(pIpC)을 7주에 5회 복강내 주사하였다. 쥐는 주사 4주 후에 분석되었습니다. pIpC 처리 후 Mx1cre/+Flt3fl/fl 생쥐 Lin-SCA-1+KIT+ 세포 및 림프조상세포(common lymphoid progenitors，CLP)의 Flt3는 거의 손실되었고 조혈모세포(HSC) 수(Lin-SCA-1+KIT+CD48-CD150+)는 유의하게 감소하였고 초기 Early Thymic Progenitor(ETP)(Lin-CD4-CD8a-KIT+CD25-) 세포는 Mx1+/+Flt3fl/fl 생쥐 보다 유의하게 낮았다(그림 3).

그림 3. Flt3 유전자 녹아웃 표현형[5].

(A) pIpC 주입 4주 후, FLT3는 Mx1cre/+Flt3fl/fl 마우스 및 Mx1+/+Flt3fl/fl 마우스의 Lin-SCA-1+KIT+ 세포 및 Lin-SCA-1lowKITlow 세포에서 발현되었습니다(n=6~8). (B-C) (B): 골수에서 LT-HSC, CD48-CD150-ST-HSC, CD48+CD150-MPP 및 CLP의 백분율입니다. (C)골수에서 ProB 세포(Lin-B220+CD43+CD19+CD24+CD93+), PreB 세포(Lin-B220+CD43-CD19+IgM-) 및 IgM+B의 백분율입니다. (D): 초기 흉선전구세포(Early Thymic Progenitor, ETP)(Lin-CD4-CD8a-KIT+CD25-), DN2(Lin-CD4-CD8a-KIT+CD25+) 및 DN3(Lin-CD4-CD8a-KIT-CD25+)의 평균 백분율입니다. (E):pIpC 주사 4주 후, Mx1+/+ Flt3fl/fl 및 Mx1cre/+ Flt3fl/fl 생쥐의 식별 및 분석. 상부 밴드는 결실된 Flt3 대립유전자(461bp), 중간 밴드는 floxed Flt3 대립유전자(282bp), 하부 밴드는 WT 대립유전자(205bp)를 나타냅니다. (F-H) CD45.2 세포 중 (F): LT-HSC, CD48+CD150-MPP 및 CLPs, (G): ProB 세포, PreB 세포 및 IgM+B 세포가 BM, (H) ETP/DN1, DN2 및 DN3 세포(n=6)에서 차지하는 비율입니다. *P<0·05；**P<0·01；***P< 0·001.

결론

생쥐의 Flt3 유전자 기능 상실과 관련된 백혈병은 잠재적인 연구 가치가 있으며, 이 유전자 돌연변이는 백혈병 및 급성 골수 백혈병의 발병기전에 대한 심도 있는 논의와 함께 이러한 질병의 치료를 위한 새로운 방법의 개발에도 사용할 수 있습니다. 

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참고 문헌:

1. Shafat MS, Oellerich T, Mohr S, Robinson SD, Edwards DR, Marlein CR, Piddock RE, Fenech M, Zaitseva L, Abdul-Aziz A, Turner J, Watkins JA, Lawes M, Bowles KM, Rushworth SA. Leukemic blasts program bone marrow adipocytes to generate a protumoral microenvironment. Blood. 2017 Mar 9;129(10):1320-1332. doi: 10.1182/blood-2016-08-734798. Epub 2017 Jan 3. PMID: 28049638.

2. You R, Wang B, Chen P, Zheng X, Hou D, Wang X, Zhang B, Chen L, Li D, Lin X, Huang H. Metformin sensitizes AML cells to chemotherapy through blocking mitochondrial transfer from stromal cells to AML cells. Cancer Lett. 2022 Feb 2;532:215582. doi: 10.1016/j.canlet.2022.215582. Epub ahead of print. PMID: 35122876.

3. Basak NP, Banerjee S. Mitochondrial dependency in progression of acute myeloid leukemia. Mitochondrion. 2015 Mar;21:41-8. doi: 10.1016/j.mito.2015.01.006. Epub 2015 Jan 29. PMID: 25640960.

4. Bailey E, Li L, Duffield AS, Ma HS, Huso DL, Small D. FLT3/D835Y mutation knock-in mice display less aggressive disease compared with FLT3/internal tandem duplication (ITD) mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 2013 Dec 24;110(52):21113-8. doi: 10.1073/pnas.1310559110. Epub 2013 Nov 19. PMID: 24255108; PMCID: PMC3876267.

5. Zriwil A, Böiers C, Kristiansen TA, Wittmann L, Yuan J, Nerlov C, Sitnicka E, Jacobsen SEW. Direct role of FLT3 in regulation of early lymphoid progenitors. Br J Haematol. 2018 Nov;183(4):588-600. doi: 10.1111/bjh.15578. Epub 2018 Sep 14. PMID: 30596405; PMCID: PMC6492191.

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