어떻게 렌티바이러스 과발현 벡터를 만들 수 있을까요?

유전자 기능 연구를 진행할 때 더하기 실험을 하는 것은 자주 쓰는 과학 연구 아이디어다.과표현 안정 전세포주 구축으로 유전자 상향 효과가 있습니다.그 중 렌티바이러스 전염은 가장 많이 사용되는 구축 방법으로,장기적이고 안정적인 조절 효과를 얻을 수 있습니다.오늘 여러분께 렌티바이러스 과표현 벡터의 구축을 소개하겠습니다.

우선 목적 유전자 서열,즉 목적 유전자의 전사본을 확정해야 합니다.그런 다음 필요에 따라 적절한 렌티바이러스 벡터 골격과 그에 맞는 소자를 선택한다.아래에는 일반적인 렌티바이러스 벡터 뼈대를 통해 서로 다른 소자의 특징을 소개합니다(그림1).

그림 1. 렌티바이러스 과표현 벡터

프러모터(promoter):유전자 5'의 상위권에 위치해 RNA 중합효소를 활성화시켜 DNA와 정확하게 결합시켜 전사(轉記)를 열 수 있도록 합니다.일반적인 과표현 실험에서,우리는 CMV,EF1α, CAG프러모터등과 같이 강한 구동 활성과 폭넓은 효능을 지닌 특성을 가지고 있습니다.CMV는 특히 종양세포,근육,간장 등의 체세포나 벽에 붙이는 세포의 유전자 표현에 적합하며 EF1α 프러모터는 줄기세포,원세대세포,조혈세포 등의 유전자 표현에 적합하며 CAG 프러모터는 면역세포와 체세포에서의 유전자 표현에 적합합니다.조직의 특이성을 담보해야 한다면 조직 특이성의 작동자를 활용해 목적 유전자를 특정한 조직이나 세포에서 잘 표현할 수 있습니다.예를 들어 CaMKIIa와 hSyn 등은 뉴런에서 특이하게 표현할 수 있고,Afp,Alb,Tbg 등은 간세포에서 특이하게 표현할 수 있습니다(표1).

표 1. 렌티바이러스 벡터 상용 프러모터(부분)

형광 태그 및 선별 태그:형광 탭은 탑재체의 표현 효율을 측정합니다.자주 사용하는 형광 라벨은 GFP,EGFP,mCherry 등으로 실제 실험 상황에 따라 선택할 수 있습니다(표2).주의할 점은 실험 중 Luciferase가 필요할 경우 EGFP를 선택하지 않는 것이 좋습니다.둘을 같은 렌티바이러스 벡터에 둘 때 Luciferase나 EGFP 중 하나는 형광을 제대로 관찰하지 못합니다.선별마크는 무항성을 제거한 세포를 선별하는데 사용됩니다.통상 진핵 저항성과 원핵 저항성이 있으며 진핵 저항성은 Puro,Neo,Hygro,BSD 등이며 원핵 저항성은 Amp,Kan으로 세균배양질 입자확장에 사용됩니다.

표 2. 자주 쓰는 형광 라벨

5' LTR과 3' LTR：5' LTR과 3' LTR 사이의 서열이 숙주 유전자에 통합되어 있습니다.따라서 목적 유전자가 삽입되는 영역이다.따라서 목적 유전자가 삽입되는 영역입니다.주목해야 할 것은 목적 유전자가 너무 길어서는 안 되며,9Kb 이상이면 렌티바이러스의 점적도를 낮출 수 있다는 점입니다.또 유전자는 반대로 표현하는 것을 권장하지 않으며 반대로 표현하는 것은 바이러스 점적도에 영향을 준다.주의할 점은 5 "LTR과 3" LTR 사이에 polyA를 넣지 않기를 권장하며,HIV는 역전사 바이러스이기 때문에 polyA는 바이러스 전사에도 영향을 줄 수 있습니다.

기타 소자：

다른 소자는 렌티 바이러스의 포장 효율,점적도와 목적 유전자의 표현 효율 등을 높이는 역할을 합니다.예를 들면Ψ은 바이러스가 필요로 하는 포장 신호를 제공합니다；RRE 는 바이러스 포장 과정에서 바이러스 RNA 가 바이러스 Rev 단백질의 핵 출력을 통과할 수 있도록 합니다；CPPT는 바이러스 게놈의 핵 입력을 증가시켜 운반체가 숙주 게놈에 통합되는 효율을 높임으로써 전도 효율을 높입니다；Kozak은 진짜 핵 생물의 번역 시작을 촉진합니다；WPRE는 바이러스 RNA의 포장 세포에서의 안정성을 증진시켜 패키지 바이러스의 효율을 더욱 높입니다；T2a는 연결자로 상하류 두 개의 두 개의 유전자를 연결하고 번역 후 T2a는 연결된 두 개의 단백질을 끊을 수 있습니다；SV40 early pA는 패키징 과정의 전사 종료를 촉진하여 바이러스 점적도를 높입니다.

실험 요구 사항에 맞는 프로모터,형광 레이블,필터 마크 등의 소자를 선택한 후 다음 단계는 제한 효소 절단 부위가 있는 조각을 얻는 것입니다.직접 합성이나 PCR 확장을 통해 얻을 수 있습니다.직접합성법은 목적 유전자의 서열에 따라 직접 합성하고,PCR확장법은 목적 유전자의 고표현 샘플인 RNA를 추출한 뒤 이를 반전사한 cDNA를 모델로 목적 단편을 얻기 위해 해당 프라이머(primer)증폭을 설계합니다.

이어 목적 세그먼트（segment）을 벡터에 연결할 수 있습니다.제한 효소 절단 부위을 가진 목적 세그먼트와 벡터 뼈대를 가진 후,연결 효소를 통해 둘을 연결하여 목적 세그먼트의 재조합체 을 형성합니다.재조합 벡터를 체감상태 세포에 변환하여 재조합 벡터를 확장하고 측정 순서를 거쳐 재조합 벡터가 잘못 구축되지 않았음을 확인합니다.

마지막으로 렌티바이러스로 포장하여 재조합 벡터와 바이러스 포장용 보조질 입자 3개를 총 293T세포로 전염시킨 후 형광 관찰을 통해 전염효율을 확인합니다.과속원심은 느린 바이러스가 있는 상청액을 수집하고 여과한 뒤 PEG-NaCl 농축으로 사탕수수 쿠션을 통해 느린 바이러스를 순수화하고,마지막으로 점적도측정과 무균 검사 등을 진행합니다.

플라스미드의 법（plasmid）사용은 외부 유전자를 표현하는 것이 간편하고 비용이 적게 들며 실험 체계가 성숙하다는 장점이 있기 때문에 대부분의 실험실에서 플라스미드의 법(plasmid)사용에 치우칠 수 있습니다.그러나 특별한 욕구가 있는 과표현 실험은 전염이 어려운 세포,유전자 안정화 필요,높은 전염이 필요한 효율성 등이라면 질적 플라스미드의 법 법칙은 우리의 욕구를 충족시키기 어렵습니다.

이때 렌티바이러스법으로 종종 더 좋은 실험 결과를 얻을 수 있습니다.운반체를 만들었을 때 렌티바이러스법의 플라스미드법에 대한 이점을 자세히 소개합니다.

1.외부 유전자는 안정적으로 통합과 표현을 할 수 있다.플라스미드법은 외원 유전자를 표현하는 데 있어서 순간적인 표현만 가능하고 외원 유전자는 숙주 세포의 분열 전대에 따라 끊임없이 손실될 수 있습니다.렌티바이러스는 외원 유전자를 숙주의 세포에 통합하는 것으로 숙주 세포의 분열이 대물림되면서 안정적으로 유전됩니다.

2.효율적인 전도효율.비교적 많은 요인의 영향을 받아 품질 플라스미드법의 전염 효율이 왕왕 높지 않습니다.세포 유형,전기매개 변수,플라스미드 크기등입니다.느린 바이러스법은 점적도가 높은 느린 바이러스를 포장할 수 있고 렌티 바이러스의 VSV-G 단백질은 광범위한 친화성을 갖고 있어 거의 모든 포유류 세포를 감염시킬 수 있어 감염 효율과 전도 효율이 높습니다.

3. 유전자 카피 수는 상대적으로 균일.플라스미드법이 전염되어 얻은 세포의 카피 수는 종종 균일하지 않습니다.일부 세포는 카피 수가 높습니다.일부 세포는 카피 수가 낮고 심지어는 없습니다.이는 목적 유전자의 세포별 표현량에 차이가 생겨 세포별로 유전표형이 차이가 나게 됩니다.렌티바이러스전도로 얻은 세포의 유전자 카피 횟수는 상대적으로 균일합니다.

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