녹아웃(KO) 마우스 | Cyagen Korea

연구 배경

gasdermin단백족은 pyroptosis의 핵심 실행자다.이 단백질족은 막공 형성 활성을 가지고 있어 세포막에 구멍을 뚫음으로써 세포의 안정 상태를 파괴하고 pyroptosis를 유발한다.gasdermin은 인간에서 다섯 개의 동원 유전자가 코딩한다.GSDMA,GSDMB,GSDMC,GSMD,GSDME가 포함된다. GSDMB-E를 활성화하는 프로테아제는 정해져 있지만 GSDMA가 어떻게 활성화됐는지는 밝혀지지 않았다.

최근 중국과학원 상하이 바스퇴르연구소 류싱 교수팀은 연쇄상구균(Streptococcus)의 독성 인자인 SpeB가 GSDMA를 절단해 상피세포의 죽음(pyroptosis)를 유발하고 체계적인 감염을 억제한다는 사실을 처음 발견했다.이번 연구 성과는 최근 국제 최고 저널인 《Nature》에 발표돼 GSDMA를 병원체 감염에 대응하는 체감기와 효과기로 확정해 숙주 면역 인식과 감염 면역 응답을 위한 새로운 기제를 밝혀냈다.

 

 

연쇄상구균Streptococcus(GAS)은 자연계에 널리 존재하며 숙주피부 및 호흡기 점막을 통해 감염되어 각종 화농성 염증을 일으킬 수 있으며 scarlet fever,erysipelas,meningitis,sepsis 등 경미하면 국소적으로 화농,무거우면 치명적이다.GAS의 피부정식 및 침투능력은 분비되는 독성 인자와 밀접한 관련이 있으며, 그 중 핵심 독성 인자 중 하나가 연쇄상구균 열원외독소 B(streptococcal pyrogenic exotoxin B, SpeB)이다.GAS 감염 후 임상적 심각도는 SpeB 발현량이 현저한 마이너스를 보이는 것과 관련이 있으나 정확한 분자 메커니즘은 밝혀지지 않다.

 

기술노선

01SpeB 은 GSDMA 를 통해 pyroptosis을 촉발

02 세포실험 추가 검증

03SpeB 촉발pyroptosis 메커니즘 연구

 

연구 결과

1//speB 는 GSDMA 를 통해 pyroptosis 촉발

연구원들은 GAS 감염에 대한 숙주세포의 응답을 연구하기 위해 GAS의 생쥐 피부 감염 모델을 이용하여 야생형 GAS 분리주와 독성 인자별 결핍균주의 병원력을 비교하였다.그 결과 야생형 및 기타 독성 인자 결핍균주는 피부 감염 부위에 심각한 화농과 괴사성 병변을 일으키지만 SpeB 결핍균주는 그렇지 않고 상피조직 손상과 호중구(neutrophil) 침윤도 현저히 감소하는 것으로 나타났다.그러나 SpeB 결핍균주에 감염된 마우스는 전신성 감염이 더 심해지고 사망도 쉬워진다.

 

이어 연구원들은 GAS 균주를 이용해 마우스의 각질세포에 감염시켜 야생형 등 균주로 인해 다량의 세포 죽고 전형적인 pyroptosis 형태를 보이는 것을 관찰했고 SpeB 결핍 균주는 pyroptosis 유도 능력을 상실했다.이 수치들은 SpeB가 상피세포 분해성 사멸을 촉발할 수 있음을 보여준다.

 

그렇다면 SpeB는 어떻게 세포사멸을 촉발시켰을까?이 중 메커니즘을 탐구하기 위해 연구진은 사람 상피세포계 A431에서 전장유전체 크리스퍼(CRISPR)를 선별했다.그 결과 표적 GSDMA의 single-stranded 가이드 RNA가 SpeB에 의해 사멸을 유도할 수 있는 세포에 고도로 풍부하게 축적된 것으로 나타났다(그림1).내원성 GSDMA가 결핍된 293T 세포의 경우 GSDMA와 SpeB의 공표현(co expression)이 pyroptosis의 형태를 초래한다.따라서 SpeB가 유도하는 pyroptosis은 GSDMA에 의존한다.

 

 

그림1. SpeB는 GSDMA 의존적인 방식으로 pyroptosis를 촉발했다

 

2// SpeB 절삭된 GSDMA-NT로 인한 pyroptosis 

연구자들은 SpeB 프로테아제가 GSDMA 를 직접 절단하고 활성화하여 pyroptosis를 유발할 수 있다고 가정한다.체외생화학 및 세포실험에서 GSDMA와 야생형 SpeB의 공표현(co-expression)으로 절단된 크기의 약 27 kDa의 N 끝 조각(GSDMA-NT)이 생성되었다는 사실을 발견하였다.더 많은 데이터는 SpeB 특이적으로 gasdermin 가족의 다른 멤버들을 절단하지 않고 GSDMA를 절단한다는 것을 나타낸다. Edman 시퀀스(sequencing)와 질량 스펙트럼 분석 결과, SpeB는 GSDMA 246위 아미노산을 절단했다.

 

연구원들은 SpeB가 촉발한 pyroptosis에서 GSDMA 절단 생성물의 역할을 더 연구하기 위해 순화된 GSDMA-NT와 GSDMA-CT(C 끝) 조각을 293T 세포로 트랜스펙션(transfection)하였다.그 결과 순화된 GSDMA-NT 세그먼트는 심각한 pyroptosis를 유발하며 전체 길이의 GSDMA나 GSDMA-CT의 트랜스펙션(transfection)은 세포활력에 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다.따라서 SpeB가 절단한 GSDMA-NT 조각은 pyroptosis를 유도한다.

 

후속 지질막 테스트 스트립과 lipidosome 결합 분석 결과 GSDMA 1-246aa는 포스파티딜세린(PS,Phosphatidylserine)과 카디오리핀(CL,cardiolipin)이 강하게 결합되어 있으며 전장 GSDMA와 GSDMA 1-214aa는 테스트 스트립(Test Strip)의 어떠한 지질와도 결합되지 않다. 또한,리포좀 누출 분석 결과 GSDMA 1-246aa가 특정 리포좀에 구멍을 낼 수 있는 것으로 나타났다.이러한 데이터는 SpeB 절단에 의해 생성된 GSDMA 1-246aa가 일부 산성지막과 결합하여 막구조를 파괴할 수 있음을 나타낸다.

 

3//Gsdma1의 부재는 항GAS 면역력을 약화시킨다

마우스의 유전체에는 세 개의 GSDMA 동원의 유전자가 포함되어 있으며, 사람 GSDMA의 SpeB 절단 위치는 마우스 Gsdma1에서만 유지된다.연구진은 재조합 SpeB를 Gsdma1-/-마우스에서 분리된 각질세포에 트랜스펙션(transfection)시켜 야생형 마우스에서 분리된 세포와 같은 pyroptosis현상이 일어나지 않는다는 사실을 밝혀냈으며, SpeB가 유도한 Gsdma1 절단이 마우스의 상피세포 초사를 유발한다는 사실을 확인했다.특히 Gsdma1-/-마우스의 피부 손상은 훨씬 가볍지만 더 심각한 전신감염이 발생할 수 있다.Gsdma1-/-마우스는 야생형 마우스에 비해 GAS 감염 시 생존율이 낮다.이는 SpeB가 이끄는 GSDMA 커팅이 숙주의 GAS 감염 방어에 중요한 역할을 하고 있음을 보여준다.

 

결론

전반적으로 GSDMA 분자는 GAS 발병인자(virulence factor)인 SpeB의 감응기와 바탕이 되는 동시에 pyroptosis를 촉발하는 면역효과기로도 활용할 수 있다는 사실을 밝혀냈다(그림2).연구자들은 숙주 면역 인식과 감염 응답의 새로운 기제를 제시해 관련 질환의 임상 치료에 새로운 아이디어를 제공할 것으로 기대하고 있다.

 

그림 2. SpeB 가 GSDMA 활성화 및 pyroptosis모델을 촉발한다

 

  

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원본 검색:

Deng, W., Bai, Y., Deng, F. et al. Streptococcal pyrogenic exotoxin B cleaves GSDMA and triggers pyroptosis. Nature (2022). https://doi.org/10.1038/s41586-021-04384-4

 

 

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