종양 면역 연구? 이 단세포 시퀀싱을 같이 보세요!

30년 이상의 암 연구와 개발 끝에 많은 표적 요법이 다양한 종양 치료에 승인되었으며 더 많은 요법이 개발 중이거나 초기 임상 시험 중입니다. 그러나 암 치료 연구에서 재발성과 내성이 있는 것으로 밝혀져 약물 개발의 어려움을 가중시켰다. 따라서 재발 방지 및 약물 내성에 대한 고효율 약물 개발이 점차 연구 핫스팟이 되었습니다.

단세포의 돌연변이는 종양 발생의 기초입니다. 따라서 복잡한 종양 환경은 개별 단일 세포로 구성된 동적 상호 작용 시스템(종양 미세 환경)으로 간주될 수 있습니다. 단세포 시퀀싱 기술은 단세포의 게놈을 특성화할 수 있으며 종양 생물학 및 유전학의 이해에 지대한 영향을 미칩니다.

단세포 시퀀싱이란 무엇입니까?

단세포 시퀀싱 기술은 단세포 게놈 또는 전사체를 시퀀싱하여 게놈 및 전사체의 오믹스 정보를 얻어 세포 집단의 차이와 세포 진화 관계를 밝히는 것을 말합니다.

단세포 시퀀싱과 전통적인 시퀀싱 방법은 무엇이 다릅니까?

전통적인 시퀀싱 방법은 여러 세포의 게놈 또는 전사체를 측정하므로 이러한 세포의 평균값만 얻을 수 있을 뿐 세포의 이질성에 대한 정보는 분석할 수 없습니다. 단일 세포 시퀀싱 기술은 단일 세포 간의 이질성을 감지하고 소량의 세포를 구별하며 세포 지도를 그리는 장점이 있습니다.

아래 그림에서 보는 바와 같이 세 그룹의 세포 중 첫 번째 그룹에는 하나의 세포가 유의한 표현형을 가지고 있고 두 번째 그룹에는 절반의 세포가 중간 정도의 유의한 표현형을 가지고 있으며 세 번째 그룹에는 모두 약한 표현형이 있습니다.이러한 세 그룹의 세포 중 WB를 사용하여 테스트한 밴드는 일관성이 있을 수 있으며 전통적인 시퀀싱 방법으로는 각 그룹 간의 유의미한 차이를 얻을 수 없습니다.

제1조

제2조

제3조

세 그룹의 세포 WB 밴드 일치할 것 같다

세 그룹의 세포의 염기서열 측정 결과에는 큰 차이가 없을 수 있다

그림1 구성 구조가 다른 세 그룹의 세포에 대해 WB 분석 및 시퀀싱을 수행하였으며, 최종적으로 얻은 결과는 동일할 수 있다. Figure generated by BIORENDER

단일 세포 시퀀싱, 즉 각 세포를 개별적으로 분석하면 세포 지도를 그려 세포 간의 이질성을 감지할 수 있습니다. 아래 그림과 같이 Memorial Sloan Kettering Cancer Center와 Columbia University 의 유방암 종양 면역 미세 환경의 단일 세포 시퀀싱 분석을 기념하기 위해 T 세포 활성화 및 분화의 다양한 단계를 반영하는 유방암 면역 맵이 생성되었습니다.

그림2 단세포 RNA 시퀀싱의 기술적 경로입니다. [1]

왜 단세포 시퀀싱으로 암을 연구합니까?

암세포의 유전적 이질성을 포착하기 위해서는 종양 조직에서 추출한 다량의 DNA를 심층적으로 분석해야 한다. 이런 방법은 세 가지 요인에 의존한다: [2]

❖게놈 DNA 를 순수화하기에 충분한 재료 (조직 또는 세포) 가 2 세대 시퀀싱 (NGS) 문고의 요구 사항을 충족시킨다；

❖시료에 존재하는 비율이 충분히 높은 클론과 서브클론체 세포 돌연변이는 검출 신호로 사용될 수 있다.

❖딥 시퀀싱을 수행하고 이러한 신호를 분석하는 능력이 있습니다.

그러나 일부 원발성 종양은 생검이 어렵고 임상의는 일반적으로 조직병리학적 검사 및 진단을 위해 암 물질을 추출하기 위해 천자(fine-needle aspiration, FNA)를 수행해야 합니다. 그러나 FNA가 항상 딥 시퀀싱을 위한 충분한 물질을 생성하는 것은 아닙니다. 따라서 단일 세포 시퀀싱은 이러한 종양의 분석에 도움이 될 것입니다.

또한, 심층 배치 시퀀싱 데이터에서 컨볼루션 클론 및 서브클로닝 세포 돌연변이를 제거하려면 데이터에서 돌연변이된 DNA 분자를 정확하게 검출해야 하는 반면, 일부 종양에서는 간질 침윤(췌장암 등)으로 인해 암세포가 샘플의 일부만 차지하고 나머지는 간질 성분으로 구성될 수 있습니다. 이것은 시퀀싱의 적용 범위에 대한 요구 사항이 매우 높습니다.

종양의 광범위한 게놈 및 전사체 연구는 암의 게놈 복잡성을 밝히는 데 도움이 될 것이며 단일 세포 시퀀싱 기술은 종양 내 유전 및 전사체 이질성을 해부하는 강력한 도구를 제공합니다.

 단세포 시퀀싱의 선진 기술

단일 세포 시퀀싱에는 어떤 제한이 있습니까?

단세포 시퀀싱 방법의 개발은 큰 진전을 이루었지만 여전히 큰 한계가 있다. DNA의 경우 대립유전자 손실(즉, 무작위, 우선 증폭 및 시퀀싱 이배체 단세포 게놈에서 특정 유전자의 두 대립유전자 중 하나), 낮은 게놈 적용 범위 및 DNA 분자 계수를 수행할 수 있는 방법의 부족과 같은 전체 게놈 증폭(whole-genome amplification, WGA)과 관련된 문제로 인해 발생합니다.(이것은 특히 배수체 암 게놈에서 대립 유전자 손실을 식별하는 데 크게 도움이 될 것입니다.). 또한, 핵산 고유의 화학적 불안정성(예를 들어, 시토신 염기의 탈 아미노 효과)과 단세포 DNA 증폭에 사용되는 중합효소와 관련된 고유 오류율은 시퀀싱의 복잡성을 더욱 증가시킵니다.

RNA의 경우 관찰된 단세포 데이터 변이를 희소성, 샘플링 편차, 낮은 수준의 전사체 유전자 발현의 손실로 인해 기술적 편차 또는 생물학적 변이에 기인하기 어렵습니다. 이러한 문제는 주로 5%에서 15% 사이의 포획 효율을 갖는 단세포 전사체 방법에서 mRNA 포획의 상대적으로 비효율성에서 비롯됩니다.[2]

단세포 시퀀싱의 응용

단세포 시퀀싱은 암 발달의 다양한 단계에서 유전 및 생물학을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 예를 들어 기원세포 (암을 발생시킬 수 있는 능력을 갖춘 세포 하위 집단), 암전 병변, 원위암, 암 전이 등의 연구 등이 있다. 종양 조직의 세포는 유전적 및 표현형 특성이 다르며 종양 세포의 이질성을 감지하여 종양 세포 및 종양 미세 환경의 세포 지도를 그립니다. 종양 조직의 세포 집단을 더욱 명확히 하고 특정 마커를 찾아 종양 발생 및 전이와 같은 일련의 문제를 설명합니다.

Figure 3 Hematoxylin 및 Acid Red 87(H&E) 염색 및 Colorectal adenocarcinoma 발달의 단계별 개략도 및 단세포 시퀀싱의 단계별 적용.[1]

CAR-T 세포 요법에서 단세포 시퀀싱의 응용

CAR-T 세포 요법은 혈액종 치료에서 상당한 진전을 이루었으며 현재 CD19 항원에 대한 6개의 CAR-T 제품, BCMA 항원에 대한 2개의 CAR-T 제품이 출시되었습니다. 그러나 CAR-T 치료는 신경독성을 포함한 다양한 부작용을 일으킬 수 있습니다. 신경독성 발생의 메커니즘은 알려져 있지 않습니다. 스탠포드 대학의 Kevin R. Parker와 Denis Migliorini 등은 단일 세포 시퀀싱을 사용하여 인간 뇌벽 세포에서 CD19 항원을 발현하는 것을 발견했으며 CAR-T 세포가 벽 세포에 'On-target, off-tumor' 공격을 하는 것이 신경 독성의 잠재적인 원인일 수 있다고 추측했습니다.[3]

이 연구는 먼저 scRNA-Seq 데이터 세트를 분석하고 인체에서 CD19 양성 세포를 식별했으며 CD19가 인간 뇌벽 세포에서 고도로 발현된다는 것을 발견했습니다.

Figure4 CD19는 뇌주위 세포에서 특이적으로 발현됩니다. [3]

이후 연구팀은 쥐 모델에서 신경독성 분석을 진행했다. CD19 양성 세포는 C57BL/6J 마우스의 뇌 조직에서 발견되었습니다. B 세포가 CD19 항원을 표현하는 것이 실험 결과에 미치는 영향을 피하기 위해 이 연구팀은 심각한 면역결핍 쥐 (NSG 마우스, B 세포 없음) 를 이용해 분석 실험을 하고 CAR-T 세포를 구축해 신경독성을 검증했다. 그 결과 쥐 유래 CD19를 표적으로 하는 CAR-T 세포는 혈액-뇌 장벽 투과성을 증가시키는 반면, 인간 CD19를 표적으로 하는 CAR-T 세포는 그러한 영향을 미치지 않는 것으로 나타났습니다.

생쥐 뇌주위 세포와 인간 뇌주위 세포의 단일 세포 시퀀싱 결과를 비교하여 생쥐 뇌주위 세포에서 CD19의 발현이 인간 뇌보다 낮고 생쥐 세포 유형 및 전사 상태의 종 특이적 차이가 인간 특이적 병태생리학과 완전히 일치하지 않을 수 있음을 발견했습니다. 초기 마우스 모델에서 수행된 CAR-T 세포 연구는 나중에 인간 임상 시험에서 관찰된 신경독성의 정도를 예측하지 못한 것으로 보고되었습니다. [4]

따라서 Kevin R. Parker와 Denis Migliorini 등은 관련 항원의 발현을 분석하기 위해 scRNA-seq 기술을 사용하는 것이 CAR-T 세포 연구에 매우 중요합니다. ScRNA-seq 는 희귀한 세포군을 포착할 수 있으며, 그 검사 지표는 과녁치료의 임상효과에 매우 중요할 수 있으며, 미래에는 CAR-T 세포의 기능이 강해지면서 여러 표적 항원의 조합을 식별할 수 있으며, 실체종 연구에도 점점 더 많이 적용될 수 있다. 실체종양은 정상 조직과 대부분의 항원을 공유하므로 단세포 시퀀싱은 효율적인 특이성의 과녁을 발견하고 설계하는 데 사용되어 면역요법을 연구하는 강력한 도구가 된다.

CAR-T세포치료 임상전 연구,  Cyagen세포치료 원스톱 솔루션

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참고 문헌:

[1] Azizi, E., Carr, A. J., Plitas, G., Cornish, A. E., Konopacki, C., Prabhakaran, S., ... & Pe’er, D. (2018). Single-cell map of diverse immune phenotypes in the breast tumor microenvironment. Cell, 174(5), 1293-1308.

[2] Baslan, T., & Hicks, J. (2017). Unravelling biology and shifting paradigms in cancer with single-cell sequencing. Nature Reviews Cancer, 17(9), 557-569.

[3] Parker, K. R., Migliorini, D., Perkey, E., Yost, K. E., Bhaduri, A., Bagga, P., ... & Satpathy, A. T. (2020). Single-cell analyses identify brain mural cells expressing CD19 as potential off-tumor targets for CAR-T immunotherapies. Cell, 183(1), 126-142.

[4] Giavridis, T., van der Stegen, S. J., Eyquem, J., Hamieh, M., Piersigilli, A., & Sadelain, M. (2018). CAR T cell–induced cytokine release syndrome is mediated by macrophages and abated by IL-1 blockade. Nature medicine, 24(6), 731-738.