녹아웃(KO) 마우스 | Cyagen Korea

Dr. Steve Yu

 

SARS-CoV-2로 인한 COVID-19의 대유행은 전세계적으로 엄청난 어려움이다. 중증급성호흡기증후군(SARS)과 숙주 분자 사이의 상호 작용 메커니즘을 깊이 연구하고, 바이러스 발병 과정을 탐구하며 SARS-CoV 감염 질환 모델을 제작하는 것은 임상 치료, 백신과 약물 개발을 지도하는 데 매우 중요한 의미를 갖는다. 백신 개발이든 신약 개발이든 유전자 치료든, 질병의 발병과 면역 메커니즘을 확인하기 위해서는 정확한 동물 모델이 필요하다.

 

1. 마우스 모델을이용하여 SARS 연구하는 의미와 이점은 무엇인가?

인간 바이러스 감염성 질환을 연구 할 때, 마우스 모델은 원가가 비교적 낮고 사육이 쉬우며 번식이 빠르다는 점과 새끼 수가 많다는 매우 분명한 장점이 있다. 더 중요한 것은 근교계 마우스의 유전적 배경이 일치하는 것이며, 이를 바탕으로 마우스의 유전자를 편집하여 필요한 모델을 제작할 수 있다. 이는 숙주의 특정 유전자가 바이러스 침투 과정에서의 영향작용을 연구하는 데 도움이 될 수 있고, 바이러스 또는 백신으로 인한 숙주 면역 시스템 반응과 그 면역 보호 작용에 대한 심층적인 이해에도 도움이 된다.

 

물론 마우스 모델에도 한계가 있다. 바이러스가 인간 또는 마우스 세포를 감염시킬 때, 보통 숙주의 특수 세포 표면 수용체에 결합하며, 숙주의 선천적 면역 반응과 같은 요인과 관련이 있다. 또한, 마우스와 인간 사이에 일정한 종의 차이가 있어 일부 인간 바이러스가 마우스를 직접 감염시킬 수 없거나, 바이러스가 마우스 체내에서 복제될 수 있지만 뚜렷한 증상을 유발하기는 어렵다. 그러므로 마우스 모델 연구 결과를 인체 연구 결과로 변환할 때는 주의해야 한다. 그러나 다양한 유형의 유전자 편집 마우스, Humanized 마우스, 또는 유전적 다양성을 가진 마우스 strain을 이용하면 wild type 마우스의 단점을 어느 정도 극복할 수 있다. 이는 숙주의 특정 유전자가 바이러스 발병 과정에서 작용하는지 연구하며 백신 및 약물의 안전성과 효과를 평가하는 데 도움이 된다.

 

2. 마우스 모델을 사용하여 SARS-CoV를 연구하는 데 어떤 전략과 방법이 있는가?

 제작 전략과 방법에 따라 현재 SARS-CoV 감염 마우스 모델은 세 가지 유형으로 나뉜다.

 

  1.  인간 SARS-CoV로 근교계 마우스를 직접 감염시킨다.
  2. 유전자 편집 기술을 사용하여 마우스의 특정 유전자를 Knock-Out하거나, 인간 숙주 세포의 SARS-CoV 결합 수용체(예: ACE2)를 마우스에 삽입한다.
  3. 야생형 SARS-CoV를 마우스의 체내에 반복적으로 적응시켜 병을 일으키는 더 강한 mouse-adapted 바이러스를 얻어 뚜렷한 임상 표현형을 유발할 수 있는 바이러스 감염 마우스 모델을 만든다.

 

SARS-CoV 감염 마우스 모델에 대한 주요 연구 진척은 다음과 같은 네 가지 측면에 집중되어 있다.

 

ⅰ. SARS-CoV의 병원성을 연구하기 위해 근교계 마우스 모델을 직접 사용

 

SARS-CoV 감염으로 인한 치사율 증가는 노인(60 세 이상)의 급성 호흡곤란 증후군(ARDS)의 증가와 관련이 있기 때문에 노인의 SARS-CoV 감염을 시뮬레이션 하는 데 더 적합한 마우스 모델을 탐색하기 위해, 어떤 연구에서는 12~14개월의 BALB/c, C57BL/6와 129S6 근교계 wild type 마우스를 이용하여 실험을 진행했다. 연구 결과에 따르면, 이 세 가지 노화 마우스는 SARS-CoV에 감염된 후 체중감소, 무질서한 모발, 곱사등, 탈수증상과 같은 단기(평균 약 7 일) 임상 표현형을 가지고 있는 것으로 밝혀졌다. 더 중요한 것은 조직 병리학적으로 혈관 주위와 세기관지 주위의 염증세포 침투, 세기관지 세포 괴사, 그리고 간질성 폐렴 발생 등의 현상을 나타낸다는 점이다. 더욱이, BALB/c 마우스의 광범위한 폐포 파괴는 9일째까지 지속될 수 있으며, 이는 인간 SARS-CoV 감염의 임상 병리학적 증상에 매우 가깝다. 이 연구는 또한 숙주별 유전적, 연령적 특징이 SARS-CoV 감염의 병원성에 큰 영향을 미칠 수 있다는 사실을 처음으로 밝혀냈으며, 바이러스 감염성 질환의 발생은 바이러스 자체의 특성뿐만 아니라 숙주 자체의 관련 요인도 매우 중요하는 역할을 한다는 점을 다시 한번 밝혔다.

  

ⅱ. 유전자 편집 기술을 이용하여 SARS-CoV 감염 마우스 모델 제작

 

hACE2 마우스 모델의 제작 전략과 관련하여, 현재는 일반적으로 상이한 조직 특이적 또는 광범위하게 발현된 프로모터와 hACE2 유전자에 의해 구축된 발현 벡터를 사용하여 전핵주입 방법으로 무작위로 삽입된 유전자 변형 마우스를 획득한다. 예를 들어, cytokeratin (상피세포 특이적 발현- K18)프로모터, CAG 프로모터(전신 발현) 또는 마우스 ACE2 유전자 프로모터를 종종 사용한다. 이러한 ACE2 Humanized 마우스 모델을 사용한 연구 결과는 hACE2의 발현 수준이 질병의 심각 정도와 직접 관련이 있다는 것을 보여준다. 이러한 마우스 모델은 모두 호흡기 상피 세포 감염을 나타냈지만, 동시에 고발현 된 hACE2 유전자는 마우스 뇌부에서도 볼 수 있다. 또한, SARS-CoV 감염 모델에서 바이러스량이 마우스 뇌부에서 증가하고 광범위하게 확산되어, 결국 마우스의 뇌염을 일으켜 사망한 것으로 밝혀졌다.

 

ⅲ. 적응실험(지속적인 감염)을 통하여 진화방식으로 SARS-CoV 돌연변이 virulent strain 획득

 

바이러스를 마우스 특이적 조직에 감염시키고 적응 진화를 수행함으로써 바이러스가 특정 생존 환경에 적응하도록 하고, 특수 조건하에 돌연변이를 발생시켜 효과적인 복제에 더 도움이 되는 목적을 달성한다. 연구진은 wild type 마우스가 뚜렷한 임상 증상(예: 체중 감소 등)을 보일 때까지 SARS-CoV 임상 균주를 BALB/c 마우스(6주령)의 비강에 15회 반복하여 접종하였다. 상이한 계대로부터 얻은 적응 치사 바이러스 균주의 비교를 통해, 바이러스에 의해 유발된 심각한 호흡기 감염의 변화와 그의 단백질의 특정 돌연변이 사이의 상관관계를 분석하는 데 도움이 되며, 바이러스와 숙주 사이에서 특이성 SARS-CoV 단백질 적응성 돌연변이의 역할에 대한 추가 연구를 위한 편의성을 제공한다.

 

ⅳ. Collaboratory Cross-CC 기술을 사용하여 유전적 배경 다양성을 가진 마우스 strain 제작

 

CC 마우스 strain을 사용하여 SARS-CoV 감염 모델을 제작하는 것은 바이러스 발병 과정에서 어떤 유전적 관련 영향 요인이 바이러스 감염성 질환에 대한 숙주의 상이한 반응을 결정하는지 알아내는 데 도움이 된다. CC 마우스를 SARS-CoV로 감염시킨 후, 표현형과 관련된 유전자를 신속하게 확인할 수 있도록 표현형별(예: 체중 감소 정도 또는 바이러스 역가의 고저 등)로 CC 마우스를 비교하고 분석한다. CC 마우스 기술을 이용하여 일부 연구자들은 SARS-CoV 감염으로 인한 발병 과정에서 바이러스에 민감성이 완전히 반대되는 CC 마우스 strain(CC003 및 CC053/Unc)을 발견했다. Gene mapping을 분석한 결과, Toll유사수용체 신호 경로에서의 압타머(Aptamer) 단백질 Ticam2는 심각한 호흡기 질환의 표현형을 결정하는 데 잠재적인 핵심 요소이다. 이러한 연구 결과에 따르면, CC 마우스는 인간 바이러스 감염 질환의 임상 표현형을 보다 객관적으로 시뮬레이션할 수 있는 새로운 종류의 마우스 모델로 사용될 수 있다.

 

3. SARS-CoV-2 연구에서 마우스 모델의 응용 현황

핵산 및 아미노산 서열을 비교 분석한 결과, SARS-CoV-2가 SARS-CoV와 유사성이 매우 높은 것으로 보여 주었다(각각 약 80% 및 76%). SARS-CoV-2는 또한 세포 표면 ACE2 수용체를 통해 숙주와의 상호 작용을 일으켜 SARS-CoV 감염과 유사한 심각한 급성호흡곤란증후군과 같은 임상 증상을 유발한다. 따라서, 위에서 소개한  SARS-CoV 감염 관련 마우스 모델의 제작 전략과 방법은 SARS-CoV-2 감염 마우스 모델의 제작에도 적합하다. 현재, SARS-CoV-2 연구에서 마우스 모델의 최신 응용 연구는 모두 중국 과학자들에 의해 수행되었다.

 

⑴ Transgenic Humanized ACE2 마우스 모델

 

중국 의학과학원 의학실험동물연구소 진천(秦川)이 이끄는 연구팀은 세계 최초로 SARS-CoV-2에 감염된 hACE2 마우스 모델 만들었다고 보도했으며,  hACE2 유전자 변형 마우스 모델은 마우스 mAce2 프로모터와 hACE2 유전자를 사용하여 제작한 벡터로, 전핵주입을 통해 hACE2 마우스 모델을 얻는다.

 

hACE2 유전자 변형 마우스가 SARS-CoV-2 바이러스에 감염된 후, 마우스는 체중이 감소하고, 폐에서 높은 수준의 viral load가 검출될 수 있다. 또한 바이러스에 감염된 마우스는 중도의 간질성 폐렴 및 폐포 간질에서 다수의 림프구와 단핵구의 침윤, 그리고 폐포 내 대식세포의 집합과 같은 병리학적 특징을 나타낸다.

 

또한 연구진은 이 hACE2 유전자 변형 마우스를 처음으로 사용하여 SARS-CoV-2 불활성화 백신의 안전성과 유효성을 평가했다. 실험 결과는 상이한 용량과 기간별의 불활성화 백신에 면역된 hACE2 마우스에서 염증과 부작용이 관찰되지 않았다는 것을 보여 주었다. 불활성화 백신의 면역원성을 검출 분석한 결과, 마우스가 SARS-CoV-2에 대한 S 단백질과 RBD 특이적 IgG를 생성하도록 유도될 수 있고, RBD 특이적 IgG는 S 단백질 항체 반응의 50%를 차지하며, RBD는 SARS-CoV-2 불활성화 백신의 주요 면역원인 것을 보여 주었다.

 

⑵ hACE2 마우스 모델의 표적 삽입

 

Chinese Procuratorate의 실험동물자원연구소가 이끄는 연구팀은 처음으로 표적 삽입 hACE2-KI/NIFDC 마우스 모델의 성공적인 제작을 보도했다. 이 Humanized 마우스의 제작 전략은 hACE2 유전자를 마우스 mAce2 유전자 프로모터 뒤에 삽입하고, 그리고 그뒤에 tdTomato 유전자를 삽입하여 Humanized 마우스가 내인성(endogenous) mAce2 유전자의 조절하에 hACE2 및 tdTomato 유전자를 공동 발현하도록 하는 것이다. 청년과 노년의 hACE2 마우스는 비강 감염을 통해 SARS-CoV-2에 감염된 후, 폐, 기관(氣管) 및 뇌에서 더 높은 viral load를 가지고 있는 것으로 발견되었으며 마우스의 비장, 신장, 간, 장과 혈청에서 바이러스 RNA가 발견되지 않았다. 또한, 청년과 노년의 hACE2 마우스는 모두 간질성 폐렴이 발생하여 염증세포 침윤, 두꺼워진 폐포중격 및 뚜렷한 혈관계 손상으로 나타났지만 감염된 마우스는 사망하지 않았다.

 

SARS-CoV-2 감염 마우스의 주요 표적 세포를 분석한 결과 Clara 세포 분비 단백질(CC10) 양성 Clara 세포는 기도에서 SARS-CoV-2의 주요 표적 세포인 것으로 나타났다. 

 

연구는 또한 위내 SARS-CoV-2 접종도 hACE2 마우스 감염을 유발할 수 있으며, hACE2 마우스의 폐 병리 변화를 초래할 수 있다는 것을 확인했다.

 

⑶ 아데노바이러스(adenovirus) 벡터에 의해 제작된 마우스 모델

 

광저우 호흡기 질환 연구소의 Zhao Jincun 교수팀은 아데노바이러스 벡터(Ad5)를 이용해 마우스의 폐에서 hACE2를 형질 도입하고 발현 시켰으며, 세계 최초의 비 유전자 변형 SARS-CoV-2 마우스 모델을 성공적으로 만들었다.

 

CMV 프로모터를 통해 hACE2 유전자를 발현시키는 아데노바이러스(Ad5) 벡터(Ad5-CMV-hACE2)를 구축하여 각각 nasal 형질 도입을 거치는 방식으로 wild type 마우스와 관련 유전자 Knock-Out 마우스(I형 인터페론 수용체 결손 마우스 또는 인터페론 경로의 핵심 유전자 STAT1 Knock-Out 마우스)를 기초로, 마우스 폐에서 hACE2 유전자가 발현되는 마우스 모델을 제작한다.

 

이러한 비 유전자 변형 hACE2 마우스를 SARS-CoV-2로 감염시킨 후, 마우스의 폐에서 고역가의 바이러스가 검출될 수 있고, 체중 감소 및 COVID-19 환자와 같은 임상 병리학적 증상이 나타났다. 이 마우스 모델 실험은 또한 I형 인터페론과 STAT1 유전자가 잠재적으로 SARS-CoV-2 감염에 저항하는 보호 작용을 가지고 있다는 것을 입증했다.

 

결론

 

동물 모델 분야의 선두주자로써 Cyagen은 전염병 발생 초기부터 회사의 연구개발 인력을 소집해 SARS-CoV-2 관련 마우스 모델 개발에 노력을 기울여 왔다. Cyagen에서 자체 개발한 TurboKnockout® 기술과 최적화된 CRISPR-Pro 기술을 활용하여 BALB/c, C57BL/6J, C57BL/6N의 3가지 strain의 hACE2 마우스를 동시에 개발하고 있다. 또한 다양한 연구 목적과 다양한 적용 방향의 요구를 충족시키기 위해 Cyagen은 다양한 유전자 편집 방법의 장단점을 고려하여 다양한 유전자 표적화 방안과 제작 전략을 설계했다.

 

COVID-19 사태가 발생한 지 반년이라는 시간이 지났으며 백신과 항바이러스 약물의 개발이 서서히 가시화되고 있다. 백신과 항바이러스 약물은 당장 감염자의 예방 및 치료에 쓰일 수는 없지만 바이러스 연구에 있어서 좋은 진전이 이루어지고 있다는 것은 분명하다. 마우스는 항바이러스 연구에 있어 중요한 역할을 하며 인류에게 큰 가치를 실현했다. 인류가 생물과 조화를 이루며 더 아름다운 지구를 만들어 나가기를 바란다.

 

References:

  1. Bao, L., Deng, W., Chuan, Q.,Huang, B. et al. The pathogenicity of SARS-CoV-2 in hACE2 transgenic mice. Nature (2020). https://doi.org/10.1038/s41586-020-2312-y
  2. Sun SH, Chen Q, Gu HJ, et al. A Mouse Model of SARS-CoV-2 Infection and Pathogenesis. Cell Host Microbe. 2020;S1931-3128(20)30302-4.DOI:10.1016/j.chom.2020.05.020
  3. Sun J, Zhuang Z, Zheng J, et al. Generation of a Broadly Useful Model for COVID-19 Pathogenesis, Vaccination, and Treatment. Cell. 2020;DOI:10.1016/j.cell.2020.06.010

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