녹아웃(KO) 마우스 | Cyagen Korea

알츠하이머병 임상연구 현황

알츠하이머병(Alzheimer Disease, AD)은 발병률과 유병률이 가장 높은 신경퇴행성 질환으로써 기억 기능 상실을 중심으로 한 다양한 증상은 질병의 발전과 함께 악화되어 환자가 사망하는 원인으로 된다. 환자들에게는 고통 그리고 가족에게는 아픔, 더나아가서 사회에는 무거운 짐이 되고 있다.

알츠하이머병에 걸린 유명인 및 주요 신경장애

그림 1. 알츠하이머병에 걸린 유명인 및 주요 신경장애

 

비록 최근 20년 동안 콜린 시스템과 글루타민 수용체를 결합한 약물이 FDA 승인을 받은 것 외에 나머지는 이미 종결된 AD 임상시험에서 실패로 끝났고 과학자와 제약회사는 AD 약물 개발에 잇따라 뛰어들고 있다. 2019 년 현재 2173 건의 AD 임상 시험이 진행 중이다.

아밀로이드 가설의 임상시험 비중이 가장 크지만(약 22.3%) 현재 Aβ를 표적으로 하는 치료제는 Aβ를 제거한 후에 인지기능이 개선되지 않은 경우가 많다. 다양한 신경 전달 물질에 대한 가설이 그 뒤를 잇고 있으며(약 19.0 %),현재 승인된 약물은 모두 이 가설과 연관되어 있지만 그 효과는 매우 제한적이며 약효가 쉽게 사라진다. tau가설은 12.7%를 차지하지만 임상 결과에 따르면 Aβ 관련 약물과 유사하여 인지 능력을 향상할 수 없다. 임상시험의 약 17.0%가 미토콘드리아 캐스케이드 가설 및 관련 가설에 대해 부적합한 맞춤형 약물을 문제 삼았고 아직까지 유망한 약물은 나타나지 않고 있다. 이는 사회적 관점에서 노화로 인한 알츠하이머병 발병률의 증가는 피할 수 없는 문제가 되었음을 보여준다. 경제적 측면에서 여러 제약 연구기관들 모두 AD 약물 개발의 잠재적인 막대한 이익을 인정하고 있기에 현재 하고 있는 연구의 성공 여부와 상관없이 신약 개발은 계속될 것이다.

2019 년 AD에 대한 글로벌 임상 시험

그림 2. 2019 년 AD에 대한 글로벌 임상 시험

 

현재 발견된 AD 마우스는 모두 약 194종이며, 검증되지 않았거나 유전자 변형되지 않은 모델을 제거하면 논문을 뒷받침하는 유전자 편집 마우스는 161가지 남게 되는데 그중 single 유전자 편집 마우스가 가장 많다. 그러나 가장 인기 있는 것은 multiple 유전자 편집의 AD 모델이다.

유전자 편집된 AD 마우스 모델의 유형 및 수량 (데이터 출처 : Alzforum).

그림 3. 유전자 편집된 AD 마우스 모델의 유형 및 수량 (데이터 출처 : Alzforum). 핑크색은 single 유전자 변형 AD질환 모델, 파란색은 double 유전자 변형 모델, 보라색은 multiple 유전자 변형 모델, 숫자는 모델의 종류를 각각 나타낸다.

 

(1) 전통적인 알츠하이머병 모델

종류를 따지자면 단일 유전자 편집 동물 중 APP에 대한 것이 가장 많았고, tau를 코딩하는 유전자인 MAPT가 뒤를 이었으며 프레세닐린 PS유전자와 β 절단효소 BACE도 중요한 지위를 차지했다. 대부분의 표적은 PS1 또는 BACE1이며 PS2와 BACE2 유전자 변형 마우스에 대해서는 연구자들은 별로 열정이 없어 보인다. APP와 PS1은 가족성 AD 질환에서 발견된 돌연변이이므로 엄밀히 말하면 이 두 유전자를 위해 설계된 모델은 표준 AD 질환 모델이다.BACE1 유전자는 AD의 돌연변이를 일으킬 수 없기 때문에 BACE1 관련 마우스는 AD 질환의 적절한 모델이 아니지만 그 기능에 대한 연구 역시 AD의 질병 발생 메커니즘을 깊이 이해하는 데 도움이 된다.

APP 가족성 돌연변이가 흔히 처음 발견하는 가족 소재지의 약어을 쓴다. 예를 들어 SWE는 스웨덴의 한 가족에서 발견되었는데 이 가족 중 APP는 두 개의 locus에서 돌연변이를 일으켰고 swe 돌연변이는 모든 AD 유전자 편집 동물 중에서 가장 많이 응용됐다. 이 외에 가족성 AD 중 돌연변이가 두 번째로 많은 PS1에서도 다섯 가지 돌연변이가 가장 많이 사용된다.

이러한 돌연변이 유전자를 배열 조합하여 발현하면 100여 종의 AD 유전자 변형 마우스 모델을 얻을 수 있다. 이 중 비교적 유명한 것은 single-transgenic APPswe의 Tg2576, double-transgenic APP/PS1 △E9과 5×FAD이다. 그 중에서 5×FAD 마우스는 가장 강한 병리적 표현형을 가지고 있고 발병 시기도 매우 이른데 이는 5×FAD 마우스는 세 가지 APP 돌연변이와 두 가지 PS1 돌연변이가 모두 도입되었기 때문이며 현재 가장 많은 돌연변이를 가진 AD 마우스이다. 주의할 점은 5×FAD의 Aβ 병리학적 표현형이 뚜렷하지만 모든 single-transgenic 마우스에서 Aβ 스플라이싱 단백질과 전구체 단백질 APP 주변에 형성된 신경세포 매듭이 없기에 사람들은 또한 전측두엽 치매에서의 MAPT 돌연변이(MAPT의 돌연변이는 tau 단백질의 인산화를 증가시킬 것임)를 도입하며 APP에서의 SWE 및 PS1에서의 M146V 돌연변이와 결합하여 AD의 모든 병리학적 표현형을 가진 3 ×TG마우스를 제작했다.

돌연변이와 질환 모델 마우스

그림 4. 돌연변이와 질환 모델 마우스

 

(2) 고전적인 알츠하이머병 모델의 표현형

2012 년 한 논문에서는 일반적으로 사용되는 AD유전자 변형 마우스를 요약했는데 그림 5와 같이 네 AD 마우스를 검은색 굵은 선으로 구분 지었다. 전기생리 실험과 행동실험은 바탕색으로 구분되며, 상단의 전기생리 실험은 기초 시냅스 신호전달 기능(BST), 장기 상승 작용(LTP) 및 쌍 펄스 촉진(PPF)을 포함한다. 아래의 행동실험을 공간 기억 행위(Spatial Memory, 수중미로와 반즈 미로 등을 포함), 작업기억(Working Memory, T/Y 미로 등), 공포기억(Fear Conditioning) 등으로 나뉜다. 또한 나이도 AD 병의 경과에 영향을 미치기 때문에 실험동물의 나이를 더 구분해 6개월 이하 젊은 그룹, 7~12개 월령 중년 그룹, 12개월 이상 노인 그룹으로 분류했다. 각각의 빨간색과 녹색 네모 칸은 모두 하나의 실험을 대표한다. 같은 논문에 여러 개의 실험이 있을 수 있는데 사실상 APP/PS1의 여섯 개의 전기생리 데이터와 3 ×TG의 전기생리 데이터도 같은 논문에서 나온 것이다. 빨간색은 유전자 변형 마우스의 기능이 대조군에 비해 손상되었음을 나타내고 녹색은 야생형 대조군과 유의한 차이가 없음을 나타낸다.

가장 많이 사용되는 AD 마우스 모델

그림 5. 가장 많이 사용되는 AD 마우스 모델
Source: Tara Spires-Jones and Shira Knafo, 2012

 

전체적으로 전기생리의 실험은 비교적 적으며, 얻을 수 있는 정보는 PFP만이 APP/PS1에서 손상을 입었을 뿐, 나머지 세 종류의 마우스는 모두 변하지 않았다는 것이다. 한편 나이가 들면서 5×FAD의 BST와 LTP도 모두 뚜렷한 영향을 받았다. 따라서 만약 이후에 우리가 전기생리 실험을 해야 한다면, 다른 유전자 변형 마우스들은 나이에 따라 시냅스 기능이 바뀔 수 있는지를 고려해야 할 것이다.

전기생리에 비해 행동학적 데이터가 훨씬 풍부하며 수중 미로를 비롯한 공간 실험, T형 미로를 비롯한 작업기억 실험과 공포 박스 실험이 있다. 그림 5에서 볼 수 있듯이 Tg2576은 12개월이 되었을 때 공간기억과 작업기억의 손상은 공통적이며 또한 원본 양식을 간소화하였기 때문에 사실 공포기억은 원래 해마가 의존하는 환경 공포기억과 해마에 의존하지 않는 소리 공포기억으로 나뉜다. 그림 속 녹색 네모 칸은 해마에 의존하지 않는 실험으로, 해마에 의존하는 실험만 보면 AD 마우스 4종이 12 월령 이후의 실험에서 모두 기억상실 증상을 나타낸 것을 보아낼 수 있다. 7~12월령 마우스의 행동실험에서 단일 유전자 과발현 Tg2576의 결과 모순이 많았는데 이에 비해 나머지 다중 유전자 변형 마우스는 전반에 걸쳐 기억에 현저한 손상을 입었다.

1~6개월의 데이터가 비교적 흥미로운데 이 시간 동안 마우스의 병의 경과는 매우 빠르게 진행되었기 때문에 여러 가지 모순된 결과가 있었다. 앞으로 집계된 시간을 더욱 세분화하여 더 많은 규칙을 발견할 수 있는지 알아봐야 한다.

여기서 우리는 만약 공포 기억 실험을 한다면, Tg2576이 충분한 데이터에 의해 축적되었다는 것을 볼 수 있는데 이는 모든 연령대의 contextual FC에 심각한 영향을 주었다는 것을 의미하며 해마의 손상이 비교적 심각한데 비해 전기생리의 표현형은 그다지 뚜렷하지 않다.

 

(3) 고전적인 모델 외 알츠하이머병 관련 유전자

AD의 발병은 가장 흔한 APP, PS1/2, MAPT 등과 밀접한 관계가 있는 것 외에도 면역 신호 통로 증의 TREM2, 콜레스테롤 대사 통로의 APOE도 GWAS 연구에서도 AD 발병률과 밀접한 관계가 있음을 보이고 있다. 세포골격 위치 결정, 에너지 대사, 유전자 발현 제어 등 통로에도 많은 유전자가 변하면서 Aβ 응집이나 tau의 인산화에도 영향을 준다. 이러한 신호 통로 및 그중에서의 단백질과 AD의 관계는 아직도 사람들의 탐색을 기다리고 있고 가장 주목받는 Aβ 항체 약물과 tau 탈인산화약이 현재 성공적인 임상 사례가 없다는 것은 치료함에 있어서 관건은 직접 병리적인 특징 자체에 없다는 것이며 Aβ와 tau는 AD가 발병한 '인'이 아니라 '과'일 가능성이 높다는 것을 설명한다.따라서 비전통적 질환 모델에 대한 유전자 연구가 AD 치료의 관건이 될 것으로 보인다.

AD 영향 통로 및 대표적인 유전자

표1. AD 영향 통로 및 대표적인 유전자

유전자 편집 모델 외에도 AD 동물 모델은 다른 방법으로도 얻을 수 있으며, 그중 노화 모델과 화학적 유도 모델이 더 일반적으로 사용된다. 유전자 편집 방법이 성숙하기 전 자주 사용된 모델링 방법은 약물이나 바이러스의 외부 주입을 통해 동물 모델을 제작하는 것이었다. 위의 방법의 장점은 모델링이 간단하고 야생 마우스로 하면 되며 모델이 빠르게 제작된다는 것이다.

아래는 가장 일반적으로 사용되는 몇 가지 비유전자 편집 AD모델과 각각의 장단점을 열거하였다.특히 이 모델들에는 노인성반점과 신경섬유매듭 두 가지 가장 중요한 AD 병리 표현형이 없기에 이 모델들은 기억손상 모델일 뿐 AD모델이라고 할 수 없다고 주장하는 학자들이 많다.

모델 유형 모델 명칭 방법 장점 단점
노쇠모델 자연노쇠 생후 12-32 개월로 자란 시점에서 실험 자연 발생;
손상간섭으로 오해한다.
Aβ 침전 없음, NFT 침전 없음, 주기가 길다.
노쇠모델 노화가속 SAMP8마우스 일부 AD 관련 염증성 병변이 있다;
학습 및 기억 장애가 있다.
비용이 높고 실험주기가 짧다.
화학모델 Aβ 주사 해마 또는 뇌실에 Aβ 주입 Aβ의 병리학적 메커니즘을 충분히 연구할 수 있다. Aβ 침전 없음, NFT 침전 없음, 주기가 길다.
화학모델 스코폴라민 유도 복부에 스코폴라민 주입 약물 주입이 편리하며 콜린 가설에 대한 연구를 수행할 수 있다. Aβ 침전 없음, NFT 침전 없다.
화학모델 스트렙토마이신 유도 뇌실에 스트렙토마이신 주입 산발성 AD의 일부 특성을 시뮬레이션 할 수 있다. Aβ 침전 없고으며 NFT 침전 없으며, 마우스가 쉽게 사망한다.

표2. AD 화학 유도/바이러스 벡터 매개 모델

 

약물 선택 외에 약을 투여 방식도 고려해야 할 문제이다. 조작이 간편한 정맥이나 복강주사는 약물의 손실이 크고 혈뇌장벽을 뚫을 수 있느냐는 문제가 있다. 따라서 많은 약물의 전송은 뇌 입체 정위 주사의 도움을 받아야 한다. 이 기술의 도움으로 약물을 표적 뇌에 정확히 주입할 수 있다. 이는 신경계에 약물이 광범위하게 작용하는 감염을 줄이는 한편 약물의 사용량을 감소시켜 중추신경계 미세화 실험의 토대를 마련하였지만 이 주사법은 고정기구 설비의 투입과 비교적 긴 시간의 학습 비용을 필요로 한다.

약물 투여 외에 바이러스 벡터를 주입하여 동물의 특정 뇌 구역에 있는 유전자를 직접 편집할 수도 있다. 이 유전자 편집은 야생형에도 응용할 수 있고 이미 유전자 편집을 거친 동물에게도 사용 가능하다. 예를 들어 AAV를 이용한 조건부 발현을 진행할 때 특이성 프로모터 +Cre 유전자 주사를 통해 Loxp 랫드에 투여할 수도 있고, Cre 동물에 유전자를 주사할 수도 있다. 그런데 첫 번째 방법은 비교적 보편적인데 이는 기존의 Loxp동물이 일반적으로 Cre동물보다 많았기 때문이며 또 용량 때문에 첫 번째 방법은 AAV의 가용성이 더 높다. 바이러스는 주사 방식이기 때문에 주사 부위, Cre의 프로모터, AAV의 혈청형 등 세 가지를 통해 유전자 발현이나 제거를 정밀하게 제어해 실험의 신뢰성을 높일 수 있다.

수술/약물 보조 모델링 및 입체정위주사

그림 6. 수술/약물 보조 모델링 및 입체정위주사

AD에 관한 행위학 실험의 종류는 매우 많은데, 대체로 네 부류로 나눌 수 있다. 학습과 기억, 운동 균형, 정신 정서적, 사회 집단 등이 있다. 이러한 네 가지 유형의 행동학적 실험은 AD의 표현형 검사에서 모두 응용되고 있으며, AD 환자 자체에도 이러한 유형의 행동 변화가 존재하고 있는데 인간, 영장류 또는 설치류 모델 모두 학습 및 기억 기능의 변화와 손상이 가장 뚜렷하다. 따라서 수중 미로, 새로운 물체 인식, 공포 기억 박스, 방사선 미로 등 행동학적 검사 방법은 AD 모델링 효과 및 약물 효능 평가에서 가장 중요한 행동 실험이다. 표3은 AD에 관한 행동학적 실험 유형 및 각종 실험 검사의 서로 다른 기억 지표를 종합한 것이며 연구 과정에서 동물의 기억 기능을 평가하기 위해 종종 하나 이상의 행동 실험이 필요하다.

AD 관련 행동 실험 개요

표 3. AD 관련 행동 실험 개요

 

많은 행동 실험에서 기간마다 초점이 다르다. 초기 연구에서 다양한 정교한 미로가 종종 신경 생물학 연구에서 주도적인 지위를 차지했다. 그러나 시간이 지남에 따라 표준화된 실험 절차가 점차 주류가 되었다. 더 흥미로운 점은 전통적인 미로에서 단순화된 T/Y 미로의 비율이 점차 감소하고 있다는 것이다. 1980 년대 초에 발명된 수중 미로 실험과 새로운 물체 인식이 AD 행동 실험의 절반을 차지했다.

AD와 관련된 주요 행동 실험의 변화

그림 7. AD와 관련된 주요 행동 실험의 변화

 

동물 행동 실험은 계획된 방식으로 설계되어야 한다. 예를 들어, 작업 기억 테스트에 사용되는 Y 미로 실험의 시점은 동물에 대한 자극이 적고 AD의 조기 기억 장애와 관련이 있는 첫 번째 위치에 배치될 수 있다. 새로운 물체 인식이라는 인지 능력의 검사도 이러한 유형의 실험에 속한다. 강한 자극이 미치는 수중 미로와 방사 수중 미로는 실험 중기에 하는 것이 좋으며, 유형에 따라 실험 전후에 일정한 간격이 있어야 하고 그림에서 언급하지 않은 공포 기억 상자는 자신의 실험 목적에 따라 조심스럽게 사용해야 하는 바 최종 행동 실험을 위해 또는 다른 실험과 더 긴 시간 간격을 갖거나 다른 동물 그룹으로 변경해야 한다. 동물이 노령에 이르면 Y 미로에서 가벼운 자극이나 새로운 물체 인식 실험으로 능동적인 선택 실험을 수행할 수 있다.

AD 행동 실험 프로세스 설정

그림 8. AD 행동 실험 프로세스 설정
(10.1371/journal.pone.0147733)

 

행동 실험에 따라 검사 지표가 다른 바 수중 미로의 검사 지표는 동물이 탈출 플랫폼을 찾는 데 필요한 시간이며 시간이 짧을수록 마우스의 기억력이 좋아진다. Y미로는 마우스가 선택 정확한 횟수와 총 선택 횟수의 비율, 그리고 선택 정확률을 집계하는 것이며 정확도가 높을수록 마우스의 기억이 좋아진다. 행성 미로는 Y 미로와 유사하지만, 집계할 수 있는 수치는 더 많다. 새 물체 인식은 새 물체에 관심이 많은 마우스의 특성을 살려 새 것과 낡은 것을 정확히 구별할 수 있는지를 검사하는 것으로, 새 물체를 더 많이 탐색하면 할수록 기억력이 향상된다.

AD 행동 실험 검사 지표

그림 9. AD 행동 실험 검사 지표

(1) Aβ와 노인성반점은 AD의 핵심 병리학적 특성이다.

AD 외에 혈관성 치매, 루이소체 치매, 전두측두엽 치매 및 헌팅톤병도 기억능력의 손상을 야기시킬 수 있기에 정확한 AD모델은 행동 이외에도 AD의 독특한 병리적 특징인 베타 아밀로이드 침전, 즉 우리가 흔히 말하는 노인성반점이 있어야 한다. APP 단일 유전자 돌연변이가 있는 Tg2576을 예로 들면 노인성반점을 구성하는 성분은 마우스의 생후 6 개월에 증가하기 시작했고, 노인성반점이 생후 9 개월에 나타나기 시작하여 병리학적 수준에서 모델의 성공적인 구축을 의미한다. 반면, Tg2576에서 MAPT 유전자의 변화가 없기 때문에 AD의 병리적 표지인 신경섬유매듭은 없지만 타우 인산화는 어느 정도 증가할 것이다.

AD의 병리적 발달 과정

그림 10. AD의 병리적 발달 과정

 

그림 10의 왼쪽 상단은 18 개월 시점의 APP/PS1 이중 유전자 변병 마우스의 뇌 조직 절편으로, 뇌 전체가 노인성반점으로 덮여 있음을 알 수 있는데 이 노인성반점은 염증을 유발하고 근처의 신경세포를 죽일 수 있으며 뇌 기능에 대한 파괴적인 영향이 생길 수 있다. 하지만 야생형 마우스의 뇌에는 명백한 노인성반점이 없다. 그림 10의 오른쪽은 3×Tg 마우스 뇌 부위의 신경섬유매듭을 나타낸다.

AD 마우스의 노인성반점 및 신경섬유매듭

그림 11. AD 마우스의 노인성반점 및 신경섬유매듭
Source: Wendy Liu, 2016

 

(2) APP 절단 과정 중의 중간 산물

APP가 Aβ로 절단되는 과정에서 많은 중간 산물이 있으며 Aβ 자체도 크기가 다르다. Aβ의 크기가 다르면 병리학적 효과의 정도가 다르게 되는데 이를테면 Aβ42의 독성은 Aβ40의 독성보다 높은 것이다. APP에는 두 가지 운명이 있는데 하나는 비 아밀로이드 침전 절단이고 다른 하나는 AD의 아밀로이드 절단이다. 앞의 APP는 먼저 알파-분비효소 ADAM에 의해 잘렸고 이 효소는 APP를 Aβ 영역의 중간부분을 절단하므로 애초에 Aβ 생성의 가능성을 차단하며 이 과정에서 APPSα, α-CTF와 P3 등 특유의 산물을 생성하였다. 두 번째 전단법은 APPSβ, β-CTF, Aβ를 생성하는데 이 산물들의 증가는 AD 병세의 심각도에 영향을 미친다. 또한 서로 다른 Aβ 형식도 AD의 발병에 영향을 줄 수 있기에 이들 성분의 비율을 체크해 보면 AD의 병리에 대해 어느 정도 이해할 수 있다.

Aβ의 스플라이싱

그림12. Aβ의 스플라이싱
(Cuadrado-Tejedor and Garcia-Osta, 2014)

 

예를 들어, 그림 12에 나와 있는 연구에서는 저자는 전술한 다양한 APP 절단 산물을 검사하였는데 유전자 편집 랫드의 APP 유전자는 β절단 경향이 있고 PS1은 보호성 돌연변이가 발생하거나 이를 억제해 β절단과 관련된 산물의 생성을 감소시킨다.

Aβ 스플라이싱의 중간 산물 검출

그림 13. Aβ 스플라이싱의 중간 산물 검출

 

Aβ 관련 산물의 분자량이 작기 때문에 WB의 검출 효과가 좋지 않아 ELISA 테스트 키트가 필요한 경우가 많다.

 

신호 경로 연구

행동과 병리가 각각 거시적, 미시적으로 AD모델의 유효성을 검증하여 '무엇인가'의 문제를 해결하고 '왜'의 문제를 해결하려면 신호 경로의 관점에서 연구해야 한다. 인체는 하나의 정교한 "장치"이며 모든 변화는 전신에 영향을 미친다. 따라서 우리의 약물을 연구하거나 왜 이런 변화가 생기는지 처리하려면 AD병리과정의 정보흐름에 대한 연구, 즉 신호통로를 둘러싼 탐구가 필요하다. 이 부분은 가장 복잡하며 또 형식화된 것이다.

신호 전달 경로는 표현형 연구의 초점이다.

그림 14. 신호 전달 경로는 표현형 연구의 초점이다.

 

15년 간의 발전을 거쳐, Cyagen의 성숙되고 안정적인 혁신적 약물개발 플랫폼은 많은 신경과학 종사자들을 위해 각종 유전자 제거 벡터, 유전자 제거 세포 모델, 유전자 제거 랫드/마우스 모델 수천 건을 구축하였고 맞춤형 모델 제작, 벡터 패키징 주사에서 행동학 실험, 병리 표지물 검사, 그리고 발병기전 탐구에 이르기까지 원스톱 서비스를 제공하는 데 주력하고 있습니다. 알츠하이머병 관련 다양한 동물 모델과 서비스를 제공할 수 있으니 관심있으면 언제든지 연락 부탁드립니다.

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