골발육의 중요한 인자인 Mmp13

매주 금요일마다 업데이트되는 Cyagen바이오 '매주마다 마우스'는 마우스 모델에 대한 이야기를 들려주며, 다양한 마우스 모델에 대해 연구자한테 알아보는 데 도움이 되길 바랍니다.오늘 이야기할 주인공은 Mmp13 유전자 녹아웃 마우스입니다.

Mmp13유전자

MMP13은 기질메탈프로테아제 가문에 속하는 콜라겐 효소의 일종으로 배아발달, 조직재조합과 같은 정상적인 생리과정에 관여하며 질병과정의 세포외 기질분해에도 관여합니다.이 단백질의 주요 기능은 뼈관절에 참여하는 Col II 분해뿐만 아니라 연골에 있는 다른 유형의 콜라겐 (예: IV 형, IX 형, 연골 기질 성분인 단백질 다당 등) 도 분해할 수 있습니다. MMP13 및 그 억제제(MMPIS)의 불균형은 Col II를 분해시키는 시작요인입니다. 정상적인 경우 연골세포의 포외기질(ECM, Extracellular matrix)에 1:1 비율로 존재하여 기질의 상대적 균형을 유지합니다.

그림 1. Mmp13 유전자 기본 정보 [4].

연구진은 MMP13 이 인간의 정상적인 조직 중 함량이 낮은 반면 골관절염 환자 중 MMP13 함량은 결합조직(connective tissue)에서 높은 표현량을 가지고 있다는 사실을 발견했습니다.MMP13 표현 하향은 골관절염(Osteoarthritis,OA) 발병을 일정 범위 내에서 억제합니다. MMP13 전사 수준이 높아지면 연골세포 내 환경의 평형이 파괴되어 질병이 더욱 심각해집니다. 이 밖에도 MMP13 은 척추의 골간단(metaphysis) 발육 불량과 관련이 있습니다. 이와 관련된 경로는 AGE／RAGE 신호 전달 경로 및 키나아제 캐스케이드(cascade)의 G 단백질 신호 전도 GTP 효소 신호 전달 경로와 관련이 있습니다.GO는 이 유전자가 칼슘 이온 결합 활성과 금속 내 펩타이드 효소 활성과 관련이 있다고 분석했습니다.

그림 2. MMP13 단백질 구조 예측 [3].

Mmp13 녹아웃 마우스

Homozygous Mmp13 노크 생쥐는 비대연골세포영역의 넓이와 소주골(Trabecular bone0의 증가된 표형이 있음

Stickens D 등은 뼈에서 어떤 세포가 Mmp13을 발현하는지 평가하기 위해 연골골화 과정의 단계별로 생쥐 정강이뼈를 제자리에 교잡합니다(in situ hybridization). Mmp13은 배아기 15일 동안 비대연골세포와 원발성골화센터에서 새로 모집한 골세포에서 발현된다(그림 3 왼쪽). 성장판이 만들어진 후 Mmp13의 표현은 비대연골세포군 끝부분과 trabecular osteoblasts에 한정됩니다(그림3 오른쪽).

그림 3. Mmp13 골화 과정에서의 표현 [5].

왼쪽 그림은 배아기 15일 야생형 생쥐 정강이뼈의 제자리 교잡 검출을 통해 Mmp13을 표현하고 있습니다.Mmp13 신호는 빨간색으로 표시됩니다. 노란색 점선은 골화의 최전선을 나타냅니다. 파란색은 Hoechst 복염제를 나타냅니다. Mmp13 표현은 비대연골세포군(HC)과 원발성골화센터(PO)에서 관찰되며, 증식연골세포(PC)군에서는 관찰되지 않습니다. 오른쪽 그림은 1주령 야생형 생쥐의 발가락뼈에 있는 Mmp13을 원위치 교잡검사로 표현합니다.그 결과 왼쪽 그림에서 관찰된 표현 패턴과 반대로 Mmp13 표현은 비대연골세포의 맨 끝 부분(화살표 지시)에 한정되며 TB는 소주골(Trabecular bone)을 의미합니다.

연골 성골 과정에서 MMP13의 결핍으로 인한 성장판 구조 변화와 Trabecular bone 증가

Alizarin Red와 Alcian Blue로 Mmp13 녹아웃 쥐의 전체 뼈를 염색한 결과 야생형 같은 둥지 쥐에 비해 모든 뼈가 크게 다르지 않고 길이가 거의 같다는 것을 알 수 있습니다 (그림 4A). 정강뼈(tibia)와 척골(metatarsus)은 성장판 닫힘에서 큰 차이가 나기 때문에 연구진은 이를 미시적으로 분석했습니다.척골(metatarsus)은 약 4주령에 성장판이 닫히고 완전히 발달한 정강뼈(tibia)가 가운데 성장판 연골이 일부 남아 있습니다. 15 일 나이에 척골(metatarsus)과 정강(tibia)이 모두 골화센터의 형성을 관찰할 수 있었습니다 (그림 4D). 이 단계에서 Mmp13 의 mRNA 가 비대 연골세포에서 높은 표현을 하고 X 형 콜라겐과 함께 위치를 잡았으며, Mmp13 은 광화 연골 기질(cartilage matrix)로 향하는 osteoblast에서도 표현된 것으로 나타났습니다.

이 연구에서 15 일 된 Mmp13 녹아웃과 야생형 쥐의 긴 뼈 사이에는 뚜렷한 차이가 없었습니다 (그림 4B,C). 따라서 Mmp13 이 부족한 경우 연골 골화의 초기 단계는 영향을 받지 않는 것 같습니다. 연구진은 또한 동물이 1 주령에 이르기 전에 Mmp13 이 쥐의 정강뼈를 녹아웃하는 비대지역도 뚜렷해졌다는 사실을 발견했습니다 (그림 4D,E). 이러한 표형의 심각도는 뼈의 유형과 높은 연관성을 가지고 있으며, 비교를 통해 정강뼈보다 척골 비대구의 확장이 더 뚜렷함을 알 수 있습니다(그림 4F, G). Mmp13 녹아웃 쥐는 출생 후 5 주 만에 뼈가 자라면서 표현형이 심각해집니다. 5주 후에는 뼈의 성장 속도가 느려지고 비대해진 연골세포군이 정상 수로 회복됩니다. 12주령에 이르면 성장판 관련 표형이 개선됩니다(그림4H,I). 또한 연구가들은 리코펜(Lycopene) 가 돌연변이된 성장판에 더 높은 염색 부착력을 가지고 있다는 사실을 발견했는데, 이는 Mmp13 이 단백질 다당의 전환에 도움이 된다는 것을 보여줍니다.

그림 4. Mmp13 녹아웃 마우스의 성장판 결함을 제거하는 조직학적 검사[5].

(A)2주령 야생형과 Mmp13이 생쥐의 전체 뼈를 노크하는 Alizarin Red/Alcian Blue 염색 결과 유전자형별로 전체 골격구조에 큰 차이가 없는 것으로 나타났습니다.

(B, C) 배아기 15일 야생형과 Mmp13 녹아웃 마우스의 정강뼈를 염색한 결과 두 유전자형의 골간에 모두 광화조직이 있는 것으로 나타났습니다.유전자형별로 증식연골세포(PC)존, 비대연골세포(HC)존, 원발성골화센터(PO) 모두 큰 차이가 없습니다.

(D,E) 10일령 야생형과 Mmp13 녹아웃 마우스의 척골 리코펜(Lycopene) 염색 결과; (F,G) 10일령 야생형과 Mmp13 녹아웃 마우스의 정강뼈 리코펜(Lycopene)염색 결과. Mmp13 은 마우스 성장판의 비대연골세포 (HC) 영역을 녹아웃해 확대합니다 (검은 막대 이중 화살표로 표시된 길이).

(H,I)12주령의 야생형과 Mmp13이 생쥐의 정강뼈(tibia)를 두드려 리코펜O(Lycopene)염색한 결과. 기존에 관찰된 비대연골 확장 표형은 개선되었지만, 리코펜 O(Lycopene)은 돌연변이 생쥐 성장판에 부착력이 더 강해 TB는 소주골(Trabecular bone)을 의미합니다.

치료방법

Mmp13이 쥐를 녹아웃하면 뼈의 발달과 관련된 문제가 있는데 사람의 Mmp13은 OA와 연관성이 매우 높습니다. OA는 임상적으로 가장 흔한 만성 관절 질환입니다. OA는 전 세계 3억300만 환자에게 병을 유발합니다. 유병률은 나이가 들수록 점점 증가하여 중장년층의 신체 건강에 심각한 위협을 줍니다.

OA의 치료는 기초치료, 약물치료, 수술치료로 구분되는데 약물치료는 OA의 중요한 치료방법으로 중·초기 OA환자에게 널리 적용되어 중장년층 환자들이 쉽게 받을 수 있습니다.전통적인 OA 치료약으로는 아세트아미노펜(acetaminophen), 비스테로이드성 소염진통제(Nonsteroidal Antiinflammatory Drugs), 아미노 포도당과 연골소, 로테프레드놀(glucocorticoids),히알루론산(hyaluronic acid), 5-HT, 노르에피네프린(Norepinephrine), Medical Chitosan, Diacereine, Platelet-rich plasma,PRP가 있는데, 대부분 증상을 완화하는 것을 위주로 합니다. 

새로운 OA약물은 인터류킨1(Interleukin-1)억제제, 종양괴사인자(TNF-α)억제제, 섬유아세포성장인자 18(fibroblast growth factor), β-신경성장인자, 전환성장인자-β억제, Wnt신호경로억제제제, 골형태단백질-7입니다.

결론

이 편에서는 Mmp13의 골발달에 있어 작용을 설명하고 있는데, 이 유전자가 골관절염과 강하게 연관되어 있어 향후 약물억제의 표적연구가 될 수 있습니다.

참고 문헌:

1. https://www.genecards.org/cgi-bin/carddisp.pl?gene=MMP13&keywords=mmp13

2. http://www.informatics.jax.org/marker/MGI:1340026

3. https://alphafold.ebi.ac.uk/entry/P45452

4. https://rddc.tsinghua-gd.org/

5. Stickens D, Behonick DJ, Ortega N, Heyer B, Hartenstein B, Yu Y, Fosang AJ, Schorpp-Kistner M, Angel P, Werb Z. Altered endochondral bone development in matrix metalloproteinase 13-deficient mice. Development. 2004 Dec;131（23）:5883-95. doi: 10.1242/dev.01461. PMID: 15539485; PMCID: PMC2771178.

6. 蒋晓瑞. 高渗诱导因子NFAT5对关节软骨细胞MMP13表达的影响[D].重庆大学,2017.

7. 朴尚. 保护素DX在骨关节炎中的治疗作用和机制研究[D].中国医科大学,2020.DOI:10.27652/d.cnki.gzyku.2020.000330.

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