연구 노트: SH-SY5Y 세포로 성공적인 유전자 편집 및 세포 배양을 하는 방법

SH-SY5Y 세포주는 신경퇴행성 질환 연구에서 가장 널리 사용되는 세포 모델 중 하나입니다. 본문에서는 성공적인 유전자 편집 및 세포 배양을 위한 protocol을 포함하여 연구 목적으로 SH-SY5Y 세포주를 활용하는 방법에 대해 자세히 설명드리겠습니다.

SH-SY5Y 세포주 응용 소개

최근 몇 년간 SH-SY5Y 세포는 면역학, 신경퇴행성 질환 및 신경독성 관련 연구에서 in vitro 연구 모델로 널리 사용되고 있습니다. 연구 데이터에 따르면 뇌의 cholesterol 수치가 높으면 β-amyloid (Aβ) 축적과 산화 스트레스(oxidative stress)를 촉진할 수 있습니다. SH-SY5Y 세포주는 특정 화합물을 첨가하면 다양한 유형의 기능성 뉴런으로 전환될 수 있어 뇌 질환 모델로 사용될 수 있습니다. 이러한 메커니즘을 더 깊이 탐구하기 위해 연구자들은 한 연구에서 SH-SY5Y 세포를 사용하여 high-cholesterol 환경이 신경 세포에 미치는 영향을 검증하였습니다.

이미지 출처:《Translational neurodegeneration》

（https://doi.org/10.1186/s40035-023-00343-3）

SH-SY5Y 세포란 무엇인가요?

Cell Line Model Name: SH-SY5Y (Human Neuroblastoma Cells)  

Catalog Number: ATCC CRL-2266  

Growth Characteristics: Grows in clusters or aggregates, with a small portion remaining in suspension  

Culture Conditions: MEM/F12 + 10% FBS + Glutamine + NEAA + Sodium Pyruvate  

Culture Environment: 95% air + 5% CO₂; 37°C

SH-SY5Y 세포주는 신경모세포종(neuroblastoma) 세포주인 SK-N-SH(ATCC HTB-11)의 세 번째 클론에서 유래한 subline입니다 (SK-N-SH → SH-SY → SH-SY5 → SH-SY5Y). SK-N-SH는 1970년, 4세 암 환자의 전이성 골종양에서 처음으로 확립되었습니다. SH-SY5Y 세포는 신경퇴행성 질환 연구에 가장 널리 사용되는 세포 모델 중 하나입니다. 성숙한 신경세포는 분열하지 않기 때문에 세포 배양이 일반적으로는 불연속적입니다. 그러나 SH-SY5Y 세포는 지속적으로 증식할 수 있으며 미분화 세포로서 신경모세포와 유사한 형태를 취하고 미성숙 신경세포 마커(marker)를 발현합니다. 또한, 유전자 편집된 SH-SY5Y 세포주는 약리학 및 신경과학 등 연구 분야에서 점점 더 중요한 연구 모델로 자리를 잡고 있습니다.

SH-SY5Y 세포의 응용

➢ 신경퇴행성 질환 연구

알츠하이머병(Alzheimer's Disease): SH-SY5Y 세포는 β-amyloid (Aβ)및 Tau 단백질 축적이 신경세포에 미치는 독성 효과를 연구하는 데 사용됩니다.

파킨슨병(Parkinson's Disease): 도파민성 신경세포의 기능 및 α-synuclein의 응집을 조사하는 데 사용됩니다.

➢ 신경독성 연구

다양한 화학 물질, 약물 및 환경 독소가 신경세포에 미치는 독성 효과를 평가하는 데 사용됩니다.

➢ 신경세포 분화

SH-SY5Y 세포는 레티노산(Retinoic Acid, RA) 또는 기타 chemical inducer를 사용하여 신경세포와 유사한 세포로 분화할 수 있으며, 이는 신경세포 분화 및 성숙의 기전을 연구하는 데 중요한 모델입니다.

➢ 유전자 기능 연구

유전자 knockout, 과발현, 또는 RNA interference 등의 기법을 통해 특정 유전자가 신경세포 기능 및 질환에 미치는 역할을 연구할 수 있습니다.

➢ 신호 전달 연구

칼슘 신호전달, MAPK/ERK 경로, PI3K/Akt 경로와 같은 신경 신호전달 경로를 연구하는 데 사용됩니다.

SH-SY5Y 세포 배양 방법

SH-SY5Y 세포는 상대적으로 민감하고 증식 속도가 느려 단일 클론을 준비하기 어렵습니다. SH-SY5Y 세포의 안정성과 실험 결과의 신뢰성을 확보하기 위해서는 연구자가 SH-SY5Y 세포의 고유한 요구 사항을 충족하는 효과적인 세포 배양 기술을 숙지하는 것이 중요합니다.

세포 배양 절차

1. 세포 해동 (Cell Thawing) 

· 원심분리용 튜브에 6 mL의 완전 배양 배지를 추가하여 해동 과정 시작하기.
· 세포를 water bath에서 해동하고, 소량의 얼음 알갱이만 남으면 water bath를 중단하기.
· 세포 현탁액을 원심분리용 튜브로 옮긴 후 원심분리 시작하기.
· 세포를 재현탁하고 적절한 크기의 배양 접시에 접종하기.
· 24시간 후 세포 부착 상태를 확인하고, 배지를 한 번 교체하기.

2. 세포 계대배양 (Cell Passaging)

· 세포를 제외한 상층액을 제거하고, 실온의 PBS로 세포를 한 번 헹구기(rinse).
· 트립신(trypsin)을 dish 바닥에 고르게 덮이도록 추가하기.
· Dish를 두드렸을 때 일부 세포가 떨어지기 시작하면 digestion을 중단합니다.
· 천천히 피펫팅하여 세포를 재현탁한 후, 원심분리용 튜브로 옮겨 원심분리하기.
· 세포를 신선한 배지에 재현탁한 후 원하는 비율로 접종하기.

3. 세포 동결 보존 (Cell Cryopreservation)

· 세포를 Digestion 진행 후 원심분리하여 세포 pellet을 얻기.
· 세포를 동결보존제에 재현탁한 후 냉동 바이알(cryovial)에 옮깁니다.
· 냉동 바이알(cryovial)을 미리 냉각된(4°C) 세포 자동 동결장치(Controlled-Rate Freezer)에 넣은 후, -80°C 냉동고에 하룻밤 보관하기.
· 다음 날 냉동 바이알(cryovial)을 액체 질소 저장소로 옮기기.

일반 세포 배양 주의사항

· 배양 비율: 높은 계대 배양 비율(passage ratio)과 낮은 배양 밀도를 피하십시오. 세포를 과도하게 배양하거나 너무 낮은 밀도로 배양하지 마세요. 1:2 또는 1:3 계대 배양 비율이 최적입니다. 배양 밀도가 낮을수록 증식 속도가 느려집니다.

· 과도한 증식: 세포가 과도하게 증식하면 서로 뭉치고 점차 떨어지게 됩니다. 세포가 떨어지기 전에 cell passage를 진행하는 것이 중요합니다.

· 세포 덩어리: Cell passage 과정에서 일부 세포 덩어리는 피펫팅을 진행할 필요가 있습니다. 피펫팅할 때 적절한 힘으로 분산시키세요.

· 배양 배지: 세포 밀도가 높을수록 배양 배지가 더 빨리 소모됩니다. 건강한 세포 성장을 유지하기 위해 적시에 새로운 배양 배지로 교체하거나 cell passage를 진행하세요.

Smart-CRISPR™ 기술을 이용한 SH-SY5Y 세포주 유전자 편집

유전자 편집 프로젝트

SH-SY5Y 세포주에서 흔히 수행되는 유전자 편집은 knockout(KO), point mutation (PM), knock-in (KI), overexpression (OE), interference 등이 있습니다. Cyagen은 단세포 클로닝(Single-cell Cloning) 조건을 최적화하여 단클론 유전자 편집 SH-SY5Y 세포주 모델을 제공함으로써 실험의 정확성과 신뢰성이 크게 향상시켰습니다. 이 방법은 신경과학 연구의 견고한 기초를 다지고 신경세포 기능 및 질환 발병 기전 연구를 더욱 정밀하게 할 수 있게 합니다.

➢ Gene Knockout

Cyagen은 Smart-CRISPR™ 세포 유전자 편집 시스템을 바탕으로 SH-SY5Y KO(knockout) 세포 맞춤화 서비스를 제공하며, 단일 클론의 homozygous 세포주를 할 수 있습니다. Cyagen의 최적화된 transfection 시스템을 통해 RNP(ribonucleoprotein)를 세포로 직접 전달하여 gRNA 절단 효율을 90% 이상 달성합니다. 이 방법은 Plasmid 및 바이러스 매개(virus-mediated) CRISPR/Cas 방법에 비해 절단 효율을 크게 높이고 off-target 효과를 현저히 줄여 타겟 DNA 서열을 더욱 정밀하게 절단할 수 있습니다.

➢ Point Mutation

Cyagen의 Smart-CRISPR™ 세포 유전자 편집 시스템을 사용하여 SH-SY5Y 세포주에 대해 정밀하고 효율적인 Point Mutation 및 Knock-in(KI) 세포 맞춤 서비스를 제공합니다. 최적화된 α-donor 시스템을 통해 인간화 Cas 단백질, gRNA, 그리고 donor DNA를 타겟 세포에 공동 transfect하여 최대 49%의 HDR(Homology-directed repair) 효율로 높은 수준의 상동재조합(Homologous Recombination)을 유도합니다. 이를 통해 첨단 연구에 유용한 단일 클론 homozygous 세포주를 제공합니다.

➢ Stable Cell Line

Cyagen은 transfection 벡터 시스템을 최적화하는 동시에 세포 생물학 분야에서 다년간 쌓아온 전문 지식을 바탕으로 성숙하고 안정적인 유전자 과발현 실험 시스템을 구축하였습니다. 이러한 시스템을 통해 외인성 유전자(exogenous gene) 또는 RNA 간섭 요소를 안정적으로 발현하는 SH-SY5Y 안정적인 cell pool 또는 단일 클론 세포주를 제공하여 단백질 발현을 10배 이상 증가시킵니다. 이는 연구자들에게 일관된 유전자 발현 연구를 위한 신뢰할 수 있는 연구 모델을 제공합니다.

유전자 편집 주의사항

· 세포 준비: 세포가 transfection 전에 좋은 상태인지 확인하고, 세포 밀도는 약 70% 정도로 유지하면 적절합니다. 현미경으로 볼 때 세포 덩어리가 너무 많지 않도록 합니다.

· 세포 분리: 소화 과정에서 세포를 최대한 단일 세포로 분산시키도록 합니다.

· 단일 클론 준비: 한계 희석 배양법(limiting dilution method)을 사용하여 단일 클론을 준비합니다. Cyagen의 맞춤형 배양 배지를 사용하고, 10% 혈청과 적절한 cytokine을 추가합니다. 클론이 관찰되면 새로운 배양 배지로 교체하고 계속 배양합니다.

· 클론 확장: SH-SY5Y 세포는 낮은 밀도에서 증식 속도가 느리므로, 단일 클론을 점진적으로 확장하는 것을 권장합니다. 96-well plate에서 시작하여 24-well, 12-well, 마지막 6-well plate로 확장하는 것이 좋습니다. 세포를 바로 큰 용기로 옮겨 확장하는 것은 피해야 합니다.

Cyagen의 맞춤형 세포주 유전자 편집 서비스

Cyagen은 세포주/iPSC 유전자 편집을 위한 원스톱 in vitro 서비스 플랫폼을 제공합니다. 이 플랫폼은 첨단 세포 reprogramming, 유전 공학, 세포 분화 기술을 특징으로 하며, 다양한 질환 응용 분야에서 세포주에 대한 in vitro 모델 개발 및 검증 서비스를 제공할 수 있습니다. Cyagen의 최적화된 CRISPR-Pro 기술은 빠른 유전자 편집을 가능하게 하며, large fragment 절단, large fragment Knockin, Point Mutation 등 다양한 세포주에서 안정적인 발현을 보장합니다.

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참고 문헌:
[1]de Dios, Cristina., de Dios, Cristina., de Dios, Cristina., Abadin, Xenia.,  and Roca-Agujetas, Vicente.. "Inflammasome activation under high cholesterol load triggers a protective microglial phenotype while promoting neuronal pyroptosis." Translational neurodegeneration.