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Di-(2-에틸헥실) 프탈레이트(DEHP) 노출은 마우스 고환에서 HIF-1α/HO-1 신호 경로를 통해 페롭토시스를 유발합니다.
연구 계획:
1. DEHP 자극이 생체 내 및 시험관 내 고환 손상을 일으킬 수 있는지 확인합니다.
2. 오믹스 분석 및 실험 검증은 HIF-1α와 같은 비정상적인 신호 경로를 나타냅니다.
3. HIF-1α 신호 전달 경로의 작용 메커니즘을 탐구합니다.
4. 체외에서 HIF-1α를 제거하여 HIF-1α의 역할을 추가로 검증합니다.
엄격한 연구를 수행하려면 프로세스의 각 단계에서 결과를 검증하는 완전한 실험 워크플로우가 필요합니다. 일반적으로 오믹스 분석은 유전자를 과학적으로 선별하는 데 사용되며, 여러 실험 결과는 교차 검증되어야 합니다. 유전자 녹아웃(KO)은 여전히 유전자 기능 연구를 위한 전통적인 전략 중 하나입니다. 성공적인 유전자 KO 세포주는 유효성 검사 결과의 정확성에 매우 중요합니다.
본 연구에서 저자들은 MEHP 자극 후 표현형 분석, RNA-Seq 분석, ChIP-qPCR 분석을 사용하여 고환 기능 장애와 관련된 조절 유전자를 확인하였습니다: HIF-1α. 그들은 또한 예비 규제 메커니즘을 발견했습니다: MEHP(생체 내 DEHP의 주요 생물학적 대사물)는 PHD를 억제하고, HIF-1α 축적 및 안정성에 영향을 미치고, HIF-1α를 핵으로 이동시키고, 라이디그 및 세르톨리 세포에서 HIF-1/Hmox1의 결합을 유도하여 HO-1 발현의 상향 조절을 유도할 수 있습니다. HO-1의 과발현은 철 과부하(저혈증), ROS 축적을 초래하고 궁극적으로 페로토시스를 일으켜 레이디그와 세르톨리 세포의 생존 가능성을 손상시킵니다.
이러한 결과를 더욱 확인하기 위해 연구원들은 후속 실험에 HIF-1α 유전자 KO(HIF-1α 유전자 KO Leydig 및 Cyagen에서 제공하는 세르톨리 세포)와 함께 레이디그 및 세르톨리 세포를 사용했습니다. Sanger 시퀀싱과 Western Blotting은 KO 세포 라인에서 HIF-1α의 성공적인 녹아웃을 확인하기 위해 사용되었습니다. 야생형 세포와 비교했을 때, HIF-1α-KO 세포주는 MEHP 자극 하에서 세포 생존 가능성 손상 정도가 상당히 개선되었습니다.
한편, 지질 과산화(그림 1B, I) 및 철 과부하(그림 1C, J)는 억제되었습니다. Hmox1과 HO-1의 발현은 각각 qPCR과 웨스턴 블랏을 사용하여 평가되었으며, Hif-1α를 녹아웃하면 MEHP 자극 하에서 Hmox1(그림 1D, K)과 HO-1(그림 1G, N) 발현 수준의 상향 조절을 역전시킬 수 있음을 보여주었습니다.
또한 MEHP 자극 후 ROS 버스트(그림 1E, L) 및 세포사(그림 1F, M) 수준도 HIF-1α 녹다운 후 감소했습니다.
Western Blotting은 녹다운 HIF-1α가 ACSL4, FTH1 및 SLC7A11의 발현을 복구하고 GPX4의 발현을 억제하는 것을 보여주었습니다(그림 1G, N). 전반적으로, 이러한 연구 결과는 MEHP 자극이 고환 레이디그 및 세르톨리 세포에서 HIF-1α 의존적인 방식으로 페롭토시스를 유발한다는 것을 시사합니다.
