세포 내에서 특정 표현형의 안정적인 발현은 상동 재조합(homologous recombination) 또는 동형방식 복구(homology-directed repair, HDR) 경로를 통해 특정 게놈 부위가 외부 돌연변이 부위로 대체되는 점 돌연변이(point mutation)를 통해 이루어질 수 있습니다. 그러나, 실제 연구 개발 과정에서는 결과가 기대에 미치지 못하는 경우가 많습니다. 세포주 개발에는 녹인(knock-in) 양성 클론과 점 돌연변이(point mutation) 동형접합자를 얻는 데 따르는 합병증부터 배양된 세포의 건강 상태가 좋지 않은 문제까지 수없이 많은 어려움이 따릅니다. 유전자 녹아웃(knock-out, KO) 세포주에 비해 점 돌연변이(point mutation) 세포주의 실험 설계 계획에는 유전자 단편의 길이, 상동 재조합(homologous recombination) 효율 등 다양한 요소를 고려해야 합니다. 또한 세포주마다 편집 및 상동 재조합(homologous recombination) 효율에서 상당한 차이를 보일 수 있어 개발이 더 까다로울 수 있습니다. 이는 특히 복잡한 인간 질병을 모델링하기 위해 현재 연구에 사용되는 많은 인체 유래 줄기세포주 및 유도만능 줄기세포(induced pluripotent stem cell, iPSC)에 해당합니다.

Cyagen은 광범위한 테스트와 프로세스 최적화를 거쳐, 더욱 심층적인 유전자 정보 분석과 더욱효율적인 gRNA 설계를 가능하게 하는 Smart-CRISPR™ 세포 유전자 편집 시스템을 개발했습니다. 당사는 이 유전자 편집 시스템을 활용하여, 점 돌연변이(point mutation) 세포주에 대한 정확하고 신속한 구축 서비스를 제공할 수 있습니다. Cyagen은 최적화 α-공여체 시스템을 활용해 iPS 세포 풀의 기존 공여체 시스템에 비해 HDR 효율을 660% 이상 높임으로써(아래 그림), 인간화된 Cas 단백질, gRNA 및 공여체 성분을 표적 세포에 이식하고 고효율 상동 재조합(homologous recombination)을 촉진하여 동형접합 모델을 생성합니다.

그림 1: 기존 공여체와 Cyagen의 최적화 α-공여체 시스템의 점 돌연변이(Point Mutation, PM) HDR 효율성 비교(HDR 분석 소프트웨어에서 생성된 % 값 기준). 유전자 1의 PM의 경우, HEK293, NCI-H1299, iPSC에 대해 최적화 α-공여체 시스템은 13%, 37%, 46%의 HDR 효율을 보였으며, 기존 공여체 시스템의 HDR 효율은 각각 1%, 3%, 6%였습니다. 유전자 2의 PM의 경우, iPSC에 대해 최적화 α-공여체 시스템은 27%의 HDR 효율을 보였으며, 기존 공여체 시스템의 HDR 효율은 0%였습니다. 유전자 3의 PM의 경우, Hep-G2에 대해 최적화 α-공여체 시스템은 40%의 HDR 효율을 보였으며, 기존 공여체 시스템의 HDR 효율은 2%였습니다. 유전자 4의 PM의 경우, HK-2 세포에 대해 최적화 α-공여체 시스템은 30%의 HDR 효율을 보였으며, 기존 공여체 시스템의 HDR 효율은 각각 2%였습니다. 표 1은 최적화 α-공여체 시스템에서 제공할 수 있는 향상된 PM 효율과 관련 데이터를 보여줍니다.