녹아웃(KO) 마우스 | Cyagen Korea
  1. Home
  2. 커뮤니티
  3. 프로모션
  4. iPSC 질병 모델: CRISPR 편집 및 안정적인 형질감염

당사의 체외 질병 모델 연구 플랫폼은 전분화능을 유지하고 동종 세포주 질병 모델 생성을 촉진할 수 있는 유전적으로 편집된 iPSCs를 제공한다.

유도만능줄기세포(iPSCs)는 단일 유전 배경을 가진 세포에서 파생되고 특정 질병 표현형을 복제하도록 맞춤화될 수 있기 때문에 질병 메커니즘을 연구하고 세포 치료 접근법을 개발하는 데 이상적인 체외 플랫폼을 제공한다.

유전자 편집 기술과 결합하면 iPSCs를 이용하여 질병의 메커니즘을 탐구하고 효과적인 신약 및 세포치료법을 개발할 수 있다. Cyagen의 iPSC 질병 모델 연구 플랫폼은 성숙한 유전자 편집 기술과 줄기세포 배양 시스템을 갖추고 있으며 iPSC 배양, 유전자 변형 및 단일 클론화와 관련된 많은 어려움을 극복했다.

또한 당사는 표현형 분석, 다양한 질병 적용 시나리오에 대한 체외 모델 구축 및 테스트, 그리고 약물 효능(약동학/약역학) 평가를 포함하여 신약 및 세포치료법 개발을 위한 원스톱 전임상 CRO 기능을 제공한다. 무료 프로젝트 상담을 받으시려면86 20-31601779로 연락하거나service-apac@cyagen.com으로 이메일을 보내주시면 된다.

유형 프로젝트 전달 기준 질 관리(QCs) 주기 주문
크리스퍼 유전자 편집 세포주(iPSCs) 녹아웃(KO) 단클론 이형 접합 세포주 1개, 튜브 2개(10^6/튜브), 실험 보고서 PCR, 시퀀싱 및 면역 형광 검사 8-12주
점 돌연변이(PM) 12-18주
녹인(KI) 12-18주
형질감염된 안정한 세포주(iPSC) 안정적인 형질감염 녹다운 발현 형질감염된 안정한 세포주, 튜브 2개/균주(10^6/튜브), 실험 보고서 qPCR, 면역 형광 검사 세포 풀 9-11주 단클론 13-15주
안정적인 과발현 균주 세포 풀 8-10주 + 유전자 합성 단클론 12-14주 + 유전자 합성
*추가 QCs 및 검출 서비스는 고객의 요구에 따라 제공된다. 핵형 분석, 비표적 분석, 유동 세포 분석, 웨스턴블롯(WB), 루시페라아제(luciferase), 증식, 세포사멸, 세포주기, 이동/침입 등은 요청 시 제공될 수 있다.
과제 Cyagen의 솔루션
iPS 세포 콜로니(Colony) 구축: 가혹한 배양 조건으로 편집 과정에서 세포가 전분화능을 잃고 분화될 수 있다. 당사는 줄기세포 배양과 성숙한iPSC편집 및 배양 시스템 분야에서 16년 간의 경험을 가지고 있다. Cyagen Biosciences의 배양 시스템을 통해 내부가 작고 크기가 균일하며 가장자리가 분명한 이상적인iPS콜로니를 배양할 수 있다.
iPSC 유전자 편집:  서로 다른 개개와 조직을 원천으로 한iPSC 간의 유전적 차이는 크고 정확한 유전자 변형을 수행하는 데는 높은 수준의 어려움이 존재한다. Cyagen은 1만 건 이상의 유전자 편집 프로젝트와 유도만능줄기세포프로젝트에 대한 풍부한 경험으로 잘 확립된 안정적인 유전자 편집 플랫폼을 보유하고 있다. 다음과 같은 이점이 있다: 1. Smart-CRISPR ™ 세포 유전자 편집 시스템: 비표적 위험이 낮은 고효율 gRNA를 과학적으로 설계할 수 있다. 2. 당사 독점 α-기증자 캐리어 상동성 HDR) 시스템: HDR 효율성은 시장 평균보다 훨씬 높은 최대 50%에 도달할 수 있으므로 공간을 차지하지 않는 수리가 가능하다. 3. 최적의 형질감염 조건: 형질감염 조건을 최적화하였으므로 당사의 형질감염 효율은 50% 이상이고 iPS 생존율은 80%에 달한다. RNP 전달 시스템: 당사는 gRNA 절단 효율과 형질감염된 세포 생존 능력을 향상시키기 위해 RNP 전달을 선택하였고 이로 인해 비표적 효과를 줄이고 최대 90%의 KO 효율을 달성하였다.
단일 클론 형성: 안정적인 단클론 iPS 세포 배양의 준비는 복잡하고 복제율이 낮다. 당사 고유의 단세포 스크리닝 기술로 단클론 형성률이 30% 이상에 달할 수 있으며, 한 번의 스크리닝으로 충분한 양성 클론을 얻을 수 있다.
당사의 Smart-CRISPR ™로 세포 유전자 녹아웃 계획 즉시 설계

Smart-CRISPR세포 유전자 편집 시스템

종합적인 유전자 편집 기술
당사는 수만 건의 성공적인 유전자 편집 프로젝트를 축적하여 체외/체내 연구를 위한 가장 복잡한 유전자 변형 세포주와 설치류 모델을 개발할 수 있다.
최적화된 iPSC 유전자 편집 시스템
당사는 iPSC 재프로그래밍의 거의 모든 측면을 개선했다. 업그레이드된 전송 벡터는 최대 50%의 HDR 효율, 50% 이상의 형질감염 효율, 80% 이상의 형질감염 실행 가능성 및 최대 90%의 KO 효율에 달하는 RNP 전달을 제공한다.
독점 Smart-CRISPR ™ 기술
Cyagen은 인공지능(AI) 기반 알파 녹아웃 유전자 편집 전문가 시스템과 CRISPR /Cas9 기술을 결합하여 업그레이드된 Smart-CRISPR ™ 세포 유전자 편집 시스템을 개발했다. Smart-CRISPR ™는 CRISPR /Cas9 기술보다 유전자 절단에서 더 효율적이며 최대 90%의 편집 효율로 프레임시프트(frameshift) 돌연변이, 단편 녹아웃(KO), 다중 유전자 녹아웃(KO)과 같은 세포주에서 다중 녹아웃(KO) 계획을 쉽게 수행하여 단백질 양성 잔류물과 같은 문제에 대한 과학적 솔루션을 제공할 수 있다.
빠른 전달
8주 이내에 안정적인 형질감염 세포주 균주를 전달하고 8주 이내에 유전자 녹아웃 전달, 12주 이내에 유전자 녹인을 전달한다.
전문적인 프로젝트 관리
우리 팀은 고객의 프로젝트 계획 문의에 24시간 이내에 응답하여 고객에게 프로젝트 진행 상황에 대한 정기적인 업데이트와 박사 팀의 기술 지원, 종합적인 전달 보고서, 그리고 필요한 만큼 다양한 클론(동형접합, 이형접합, 제어) 세포를 전달하는 기능을 제공하는 것을 목표로 한다.
① iPSC-EGFP-KI 세포 모델 구축
② iPSC-hTNFAIP8L2-KO세포 모델 구축

CRISPR /Cas9 유전자 편집 기술을 이용하여 iPSCs의 유전자에 EGFP 형광 마커(700bp)를 삽입하였다. 그림과 같이 exon E2의 업스트림과 다운스트림에 sgRNA를 설계하였고 EGFP를 포함하는 도너(Donor) 서열도 설계하였다. RPN 방법을 이용하여 sgRNA와 도너(Donor)를 유도만능줄기세포에 형질감염시키고 EGFP 서열은 HDR(homology-directed repair) 경로를 통해 exon E2 서열 후반부에 삽입하였다.

그림 1: EGFP 녹인 방식 설계

PCR로 확인하고 시퀀싱한 결과, exon E2 서열 이후에 EGFP로 삽입된 이형 접합 유도만능줄기 세포주가 얻어졌다는 것을 확인하였다. 세포배양 후 G-밴드 염색체 분석(G banding)으로 핵형 분석을 진행한 결과 염색체 수는 46개로 정상이었고 구조적 이상은 없는 것으로 나타났다. 면역 형광 염색을 통해 3개의 전분화능(줄기 관련) 마커 유전자인 NANOG, OCT4, SOX2의 발현이 검출되었고 양성 신호가 관찰되어 유전자 편집된 녹인 세포가 전분화능을 가지고 있음을 알 수 있었다.

마커
WT:2430bp; KI:3213bp

참고: 기본 설계 전략은 EGFP 서열 전체와 업스트림 및 다운스트림 게놈 서열의 일부를 증폭하는 것이다. EGFP 삽입이 없는 밴드 패턴은 2430bp이며 EGFP의 성공적인 삽입은 3213bp의 밴드를 초래할 것이다. 결과적으로 8개의 단일 클론(1~8번)이 2430bp와 3213bp 모두에 밴드를 가지고 있으며 이는 이러한 클론들이 EGFP를 성공적으로 삽입한 이형 접합 클론이라는 것을 나타낸다.

그림 2: iPS-EGFP KI 아가로스 겔 전기영동 확인 결과

KI 밴드 5' 서열:
AGGCAGAAACAGAAAAGAATGAAATATTCCGCCGGCAT--TGGAAGCGGAGCCACGAACTTCTCTCTGTTAAAGCAAGCA
KI 밴드 3' 서열:
CGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAA--AAGACTCTTGGCCTCTCCAGAGACGCCCCTTTCCTCGTCC

참고: KI 밴드 5' 서열은 EGFP 삽입 단편의 5' 말단 서열과 업스트림 게놈 서열의 일부를 표시한다. KI 밴드 3' 서열은 EGFP 삽입 단편의 3' 말단이고 다운스트림 게놈 서열의 일부이다. KI 밴드 5' 서열과 녹인 밴드 3' 서열의 시퀀싱 분석은 모두 EGFP와 일치하고 피크가 중첩되어 있다. 이는 클론이 EGFP 삽입 단편의 이형 접합 클론임을 증명해준다.

그림 3: iPS-EGFP KI 시퀀싱 결과

그림 4: iPS-EGFP의 핵형 분석(세포배양 후 G-banding 으로 핵형 분석을 진행한 결과 염색체 수는 46개로 정상이었고 염색체 구조에 뚜렷한 이상은 없는 것으로 나타났다)

그림 5: 전분화능 마커에 대한 iPS-EGFP 면역 형광 염색(NANOG, OCT4, SOX2, 이 3개의 전분화능 마커 유전자를 검출하기 위해 면역 형광 염색이 진행되었는데 3개의 마커 모두에서 양성 신호가 검출되었고 이는 형질감염된 세포가 전분화능을 가지고 있음을 보여주었다).

인간 TNFAIP8L2 유전자는 CRISPR /Cas9 유전자 편집 기술을 사용한 iPSC에서 녹아웃되었다. TNFAIP8L2의 exon 2에 2개의 sgRNA를 세팅하여 작은 조각 삭제법으로 엑슨 2의 300bp를 삭제하였다. TNFAIP8L2 유전자 녹아웃을 가진 동형 접합 IPS 세포를 PCR와 시퀀싱으로 확인하였다. 녹아웃 세포의 전분화능은 면역 형광 염색으로 전분화능 마커 NANOG, OCT4, SOX2의 양성 신호를 검출하면서 추가로 확인되었다.

그림 1: hTNFAIP8L2 삭제 전략

그림 2: iPSC-hTNFAIP8L2-KO 시퀀싱 감지

그림 3: iPSC-hTNFAIP8L2-KO 전분화능 감지

PAGE TOP