야생형 AAV 바이러스를 유전자 치료에서 전달 벡터로 널리 사용하고 있지만, 조직 특이적 벡터 발현에는 여전히 제한 사항이 존재합니다. 이러한 제한 사항을 극복하기 위해 Cyagen은 인공 지능 보조 고효율 스크리닝 기술을 개발하여 체외 세포 또는 체내 동물 모델 연구를 위한 차세대 AAV 벡터를 제공하고 있습니다. 표준화된 바이러스 역가를 가진 고품질 AAV 벡터가 정제되고 임상 전 연구를 위해 준비되도록 보장합니다.
신경퇴행성 질환 연구를 예로 들면 천연 AAV9 혈청형은 혈액-뇌 장벽의 존재로 인해 뇌를 전달하는 능력을 심각하게 제한합니다.전통적인 방향 진화 및 합리적인 설계 방법은 제한된 수의 AAV9 변이체를 생성하고 시간이 많이 걸립니다. 따라서 Cyagen은 AI 기술을 사용하여 고성능 및 다양한 서열 변이체의 설계를 지도합니다. 마우스의 체내에 주사한 후 NGS 시퀀싱을 사용하여 결과를 추적하여 중추 신경계에서 고특이성 및 발현되는 많은 수의 AAV9 변이를 스크리닝했습니다.
우리 내부에서 개발된 인공지능 기술과 습식 실험실 방법을 사용하여 특정 부위를 보다 안전하고 편리하며 정확하게 표적화하는 새로운 AAV 캡시드 변이체를 제공할 수 있습니다. 이들의 특이성과 형질도입 효율은 다차원 데이터 분석에 의해 확인되었습니다. 신경, 안과 및 기타 질병에 대한 연구를 지원하기 위해 이제 다양한 AAV 캡시드 변이체에 대한 무료 시용을 제공합니다. 우리는 해당 질환에 대한 연구와 약물개발을 추진하기를 기대합니다. 언제든지 86 20-31601779로 전화하시거나 service-apac@cyagen.com으로 이메일을 보내주시기 바랍니다.
이벤트 기간: 2024년 3월 21일 - 2024년 5월 31일
AAV9 캡시드 변이체 무료 시용
AAV2 캡시드 변이체 무료 시용
| Group | Virus | Expression Capacity in Different Brain Regions | Trial Dosage of CAG-EGFP | Apply for Trial | |||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| Hippocampus | Cortex | Corpus Callosum | Midbrain | Spinal Cord | Liver | ||||
| Wild-type Control | AAV9 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1E12vg | |
| Positive Control | AAV9.phpeB | 13.2 | 17.3 | 12.8 | 20.2 | 18.7 | 0.16 | 1E12vg | |
Novel AAV9 Capsid Variant 1
|
PM167 | 18.5 | 19.2 | 16.4 | 23.2 | 24.4 | 0.25 | 1E12vg | |
| Novel AAV9 Capsid Variant 2
|
PM170 | 8.6 | 13.2 | 5.9 | 25.3 | 19.7 | 0.14 | 1E12vg | |
| Group | Virus | Retinal Back Layer Penetration Capability |
Whole-Eye Expression Capability |
Trial Dosage of CAG-EGFP |
Apply for Trial |
|---|---|---|---|---|---|
| Wild-type Control | AAV2-WT | 0 | 1 | 5E10vg | |
| Positive Control | AAV2.7M8 | 1 | 2 | 5E10vg | |
| Novel AAV9 Capsid Variant 1
|
PM077 | 3 | 10 | 5E10vg | |
| Novel AAV9 Capsid Variant 2
|
PM021 | 1.5 | 12.5 | 5E10vg | |
| Novel AAV9 Capsid Variant 3
|
PM054 | 10 | 15 | 5E10vg |
| Service | Specification | Titer | Timeline | Order |
|---|---|---|---|---|
| Adeno-Associated Virus (AAV) Packaging |
1×10¹² GC | ≥5×10¹² GC/ml | As Fast As 3 Weeks | |
| 2×10¹² GC | ≥5×10¹² GC/ml | |||
| 5×10¹² GC | ≥1×10¹³ GC/ml | |||
| 1×10¹³ GC | ≥1×10¹³ GC/ml | |||
| 2×10¹³ GC | ≥1×10¹³ GC/ml | |||
| Others | Others |
| Service | 규격 | Titer | Timeline | Order |
|---|---|---|---|---|
| Adeno-Associated Virus (AAV) Packaging |
1×10¹² GC | ≥5×10¹² GC/ml | As Fast As 3 Weeks | |
| 2×10¹² GC | ≥5×10¹² GC/ml | |||
| 5×10¹² GC | ≥1×10¹³ GC/ml | |||
| 1×10¹³ GC | ≥1×10¹³ GC/ml | |||
| 2×10¹³ GC | ≥1×10¹³ GC/ml | |||
| Others | Others |
*또한, 우리는 다른 규격의 AAV 바이러스와 렌티바이러스 및 아데노바이러스와 같은 다른 바이러스 유형에 대한 패키징 서비스를 제공할 수 있습니다. 문의사항이 있으시면 86 20-31601779로 전화하시거나 service-apac@cyagen.com으로 이메일을 보내주시기 바랍니다.
데이터 검증
Cyagen은 AAV9 캡시드 단백질을 최적화하기 위해 빅데이터, 클라우드 컴퓨팅, 기계 학습 및 기타 기술을 통합한 인공지능 플랫폼을 개발했습니다. 이로 인해 많은 후보 변이체 생성되었습니다. 결과는 예측된 간 탈표적화 데이터에 대한 높은 신뢰 수준을 보여주며, PearsonR 상관 계수는 0.884까지 상승합니다. (그림 1).
그림 1. 예측된 간 감염 효율
AI 예측 시퀀스에서 선택한 최상위 시퀀스는 각각 마우스 꼬리정맥 주사 (5E11 vg/각) 를 통해 검증되고 21 일 후 검사됩니다. 체내 영상 결과 (그림 2) 에 따르면 PM167 은 PHP 보다 훨씬 더 좋은 간 탈표적화을 보였다. PM170 의 간 탈표적화는 야생형 AAV9 (WT) 보다 훨씬 우수하며 PHP.eB 보다 약간 높다.
그림 2. 간 감염 효율의 생체 내 검증(In Vivo Imaging - Luc)
마우스에 꼬리 정맥 주사(5E11 vg/각) 및 21일 잠복기 후, 동결절편 결과 (그림 3) 에 따르면 PM167 의 간에서의 녹색 형광단백질 신호는 PHP.eB 보다 현저히 낮습니다. 반면 PM170 은 간에서 녹색 형광 단백질 신호를 PHP 보다 약간 높게 표시합니다. 하지만 야생형 AAV9 (WT) 보다 훨씬 낮습니다.
그림 3. 간 감염 효율의 생체 내 검증(동결절편 EGFP)
Cyagen은 AAV9 캡시드 단백질을 최적화하기 위해 빅데이터, 클라우드 컴퓨팅, 기계 학습 및 기타 기술을 통합한 인공지능 플랫폼을 개발했습니다. 이로 인해 많은 후보 변이체 생성되었습니다. 결과는 예측된 중추 신경계 표적화 데이터에 대해 높은 수준의 신뢰도를 보여줍니다(그림 4), Pearson 상관 계수는 0.843까지 상승했습니다.
그림 4. 예측된 중추 신경계 감염 효율
AI 예측 시퀀스에서 선택한 최상위 시퀀스는 각각 마우스 꼬리정맥 주사 (5E11 vg/각) 를 통해 검증되고 21 일 후 검사됩니다. 생체 내 이미징 결과(그림 5)는 뇌에서 Top 서열의 높은 축적을 보여줍니다. PM167에 의해 발현되는 뇌 내 Luc 신호 강도는 PHP의 약 2배입니다. PM170이 뇌에서 발현하는 Luc 신호 강도는 약 PHP. eB의 1.5배입니다.
그림 5. 뇌 감염 효율의 체내 검증(In Vivo Imaging, Luc)
중추신경계의 다양한 영역에서 Top 시퀀스의 분포를 더 자세히 조사하기 위해, 우리는 마우스에게 꼬리 정맥 주사(5E11 vg/각) 및 21일 잠복기 후에 마우스에서 또 다른 검사를 수행했습니다. 동결절편 결과(그림 6)에 따르면, PM167의 녹색 형광 단백질 신호는 다양한 뇌 영역(cortex, corpus callosum, hippocampus, midbrain) 및 척수에서의 PHP.eB보다 훨씬 높습니다. PM170은 corpus callosum을 제외한 다양한 뇌 영역과 척수에서의 PHP.eB보다 더 높은 녹색 형광 단백질 신호를 나타냅니다.
인공 지능 예측 시퀀스에서 선택된 TOP 시퀀스는 동일한 비율로 단일 테스트 항목으로 모아지고 각각 바코드된 도입 유전자 보고서를 전달하는 데 사용됩니다. 우리는 혼합 시험 물질(총 5E12 vg)을 non-human primate (♀, 3.6kg)의 cisterna magna에 주사했습니다. 생존 16일 후, 동물을 희생시키고 차세대 시퀀싱(NGS) 및 조직학 검사 위해 조직을 처리했습니다.
Cyagen AI-AAV 플랫폼을 사용하여 고용량 돌연변이 플라스미드 라이브러리를 구축하고 바이러스 라이브러리를 패키징하고 NGS 시퀀싱을 수행합니다. 우리는 AAV2 생산 예측 모델을 구축하기 위해 DualConvLSTM 네트워크를 구축했습니다. 모델의 신뢰성은 테스트 세트에서 검증되었으며 Pearson=0.929 및 Spearman=0.859와 높은 상관 관계를 달성했습니다(그림 9). 또한, AI 생성 망막 타겟팅 모델은 테스트 세트에서 Pearson=0.874 및 Spearman=0.871의 상관 관계를 보였습니다 (그림 10).
우리는 높은 생산 및 발현 능력을 가진 변이체를 예측하기 위해 생산 모델과 망막 표적 인공지능 모델을 사용했습니다. 우리는 top 시퀀스를 선택하고 RC 돌연변이 플라스미드를 구성했습니다. 이 플라스미드는 와일드타입 AAV2 플라스미드 및 7M8 플라스미드와 별도로 패키징되어 Luciferase 바이러스를 생산했습니다. 바이러스 패키징, 정제 및 QPCR 역가 테스트 후, 모든 세 가지 변이체는 AAV2 및 AAV2.7M8과 비교하여 더 높은 수율을 보였습니다. 특히, PM054의 수율은 AAV2의 3.48 배였습니다. PM021과 PM077의 생산율은 각각 AAV2의 1.5 배 및 2.01 배였습니다.
그림 11. AI가 예측한 AAV2 변이체 바이러스 생산량
패키징된 Luciferase 바이러스를 눈당 3E+9 vg(바이러스 게놈)의 용량으로 마우스의 유리체강에 주입했습니다. 3주 후, 생체내 이미징(그림 12)과 화학발광 분석을 모두 사용하여 Luciferase 발현이 검출되었습니다. 생체내 영상화 결과는 세 가지 변이체 모두에 대해 Luciferase의 신호 강도가 AAV2 및 AAV2.7M8의 신호 강도보다 높았음을 보여주었습니다.
더 정확한 정량을 위해 마우스를 안락사시키고, 화학발광 검출을 위해 안구를 수집하고 균질화했습니다. PM054 변이체 AAV2의 15배에 달하는 가장 높은 Luciferase 발현 수준을 나타냈다. PM021과 PM077은 각각 AAV2의 12.5배와 10배의 Luciferase 발현 수준을 가졌습니다.
그림 12. In vivo Validation of Whole Eye Expression Capability (In Vivo Imaging)
그림 13. In vivo Validation of Whole Eye Expression Capability (Chemiluminescence)
변이체의 생체 내 감염 효율을 추가로 검증하고 감염된 세포 유형을 탐색하기 위해 EGFP 바이러스를 패키징하여 마우스의 vitreous cavity(눈당 3E+9 vg)에 주입했습니다. 3주 후 fundus fluorescence photography을 통해 전체적인 EGFP 발현을 확인하였고, 병리학적 검사를 위해 안구 시료를 채취하였다. fundus photography 결과(그림 14)에서는 PM054의 GFP 신호가 가장 강한 것으로 나타났으며, 세 가지 변이체 모두의 형광 신호가 AAV2 및 AAV2.7M8의 신호보다 현저히 높았습니다.
안구의 동결절편에 DAPI 염색을 실시하였고, 결과는 세 가지 변이체의 감염 범위가 AAV2-WT 및 AAV2.7M8보다 크다는 것을 보여주었습니다. 특히, PM021과 PM054는 거의 전체 망막 영역에 감염될 수 있었습니다. 감염 깊이에서 AAV2-WT는 RGC 층 세포만 감염시키는 반면 AAV2.7M8은 특정 침투 능력을 가지고 있으며 소량의 후망막 시신경 세포(optic nerve cells)를 감염시킵니다. 세 가지 변이체 모두 AAV2-WT 및 AAV2.7M8보다 더 큰 침투 능력을 나타내어 RGC에서 PRC까지 망막의 다양한 층에 있는 세포를 감염시켰습니다. 그 중 PM054는 시신경 세포(optic nerve cells)에서 가장 좋은 감염률과 발현을 보였으며, 후방 망막(posterior retina )의 감염성은 AAV2.7M8의 약 10배에 달했습니다.
플랫폼 장점
