CAR-T세포 요법의 경우 CAR 분자가 치료 효과의 핵심입니다. CAR 분자 구조에는 종양 항원을 인식하는 항체 single-chain variable regions 및 hinge regions, intracellular co-stimulatory도메인 및 신호 도메인이 포함됩니다. 그 디자인의 합리성은 살상 효과, 체내 지속성과 안전성 등에 영향을 미칠 것이다.따라서 다양한 종양 치료 표적에 대해 합리적이고 효과적인 CAR 분자를 디자인하고 후속 CAR-t 세포 구성을 위해 CAR 렌티 바이러스로 포장(package)해야 합니다.

CD19 항원을 발현하는 렌티 바이러스 정제 용액을 순차적으로 희석(0.01, 0.1, 1, 10μl)하고 동일한 수의 293T 세포에 각각 첨가하였다. 72시간 후, 유세포 분석(flow cytometry)은 293T 세포 양성률을 검출하여 바이러스의 Transduction titer 공식에 따라 계산했다.

그림 1에서 보는 바와 같이 transfected virus gradient가 증가함에 따라 CD19 antigen-positive 세포의 수가 점차 증가하여 렌티 바이러스가 우수한 감염 활성을 가짐을 나타내며, 바이러스 역가는 위의 공식에 따라 1.4×10^8 Tu/ml로 계산된다.

위의 방법으로 293T 세포를 형질감염시켜 CD19 바이러스를 성공적으로 제조하고, 여러 번 스크리닝 후 거의 100%의 양성률로 CD19-293T 세포를 얻었다. 양성률 테스트 결과는 아래 그림과 같습니다.

우리는 CD19 표적에 대해 설계된 2세대 고전 CAR 분자를 렌티 바이러스 벡터에 구축하고 CD19-CAR 렌티 바이러스를 패키지했습니다. 위의 방법을 사용하여 바이러스 역가를 검측하고 4.33×10^8 Tu/ml의 바이러스 역가를 계산했습니다.

CAR 바이러스의 패키징이 완료된 후 다음 단계는 T 세포를 형질감염시켜 CAR-T 세포를 얻는 것입니다. 우리는 고순도 T 세포(CD3+ 세포의 비율은 98% 이상)를 제조할 수 있는 두 가지 고효율 T 세포 제조 방법을 확립했지만 두 가지 방법으로 증폭된 서로 다른 아형 T 세포의 비율은 상당히 다릅니다.

방법 1에 의해 증폭된 T세포는 주로 CD8+T세포의 아형이며, 방법 2에 의해 증폭된 T세포 집단에서 CD8+T세포와 CD4+T세포의 비율은 거의 차이가 없다.두 방법 모두 서로 다른 아형 T 세포의 역할을 연구하기 위한 견고한 기초를 제공합니다.

만성 바이러스(LVs)는 CAR-T 세포를 구성하는 중요한 유전자 전달 도구이다.T 세포 활성화 및 증폭 방법의 차이, 형질감염 횟수 등과 같은 많은 요인이 CAR-T 세포의 양성률에 영향을 미칩니다. 우리는 다양한 실험 조건을 최적화하여 렌티바이러스 형질감염 기반 효율적인 CAR-T 세포 생산 공정을 성공적으로 확립했습니다.

아래 그림은 CD19 CAR-T 세포의 양성률 검출 결과를 보여준다.CD19 항체 FCM63 클론에서 파생된 단일 가닥 항체가 이 구조에 사용되었으므로 형질감염 효율은 항-fmc63 단일 가닥 항체에 의해 검출될 수 있었습니다.결과는 CD19 CAR-T 세포의 양성률이 45.59%에 도달할 수 있음을 보여주었고 높은 양성률의 CD19 CAR-T 세포를 성공적으로 구성했습니다.

CAR-T 세포가 구축되면 관련 약물 효능 평가를 수행할 수 있습니다.일반적으로 CAR-T 세포가 표적 세포에 미치는 살상 효과를 관찰하기 위해 다른 effect-to-target 비율이 사용된다. 우리는 CD19 CAR-T 세포와 T 세포를 48시간 동안 다른 effect-target 비율의 Nalm6 세포와 함께 배양하고 flow cytometry 분석에 의해 종양 세포 사멸을 검측했습니다.

그림에서 보는 바와 같이 CD19 CAR-T 세포는 T 세포 그룹과 비교하여 다양한 유효 표적 비율 조건에서 Nalm6 세포에 대한 특정 세포독성 효과가 유의하게 향상되었습니다.