녹아웃(KO) 마우스 | Cyagen Korea

장은 인체의 중요한 소화와 흡수의 장소이자 최대 면역기관이다. 장미생물군, 면역 세포와 점막장벽은 인체 건강의 중요한 방어선의 하나로 장 상피의 호메오스타시스를 공동 구축한다. 다음으로 아래 Journal of Experimental Medicine지에 실린 논문을 정독해 보고자 한다. 이 연구는 소장상피세포(IEC)를 통한 T세포의 분화(IEL, 상피내 림프구)를 조절하는 분자 메커니즘을 최초로 밝혀냈으며 미생물군이 소장의 MHCIII와 PD-L1 및 IEL의 상피 분화에 매우 중요하다는 사실을 발견했다.

 

 

고전적 CD4+  T세포가 소장에서 CD4+CD8α+ 상피내 림프구(intraepithelial lymphocytes, IELs)로 분화될 수 있으만 이들 주변의 소장상피세포(intestinal epithelial cells, IECs)의 역할은 아직까지 명확하지 않다. 최근에 Dr. Moon이 이끄는 한국팀의 연구 결과, IECs가 소장 말단에서 미생물군과 IFN-γ의 자극에 의해 MHC II분자와 프로그램된 사멸 리간드-1(programmed death ligand-1,PD-L1)의 발현을 통해 niche 적응신호를 제공하여 CD4+CD8αα+ IELs(DP IELs)의 분화를 촉진할 수 있다는 것을 발견했다. 이번 연구결과는 Journal of Experimental Medicine지에 발표되었다[1].

비고: 아래에 SP는 CD4+ single positive 세포를 말하며, DP는 CD4+CD8+ double positive 세포를 말한다.

 

1. IELs의 분화는 IECs 에서 MHC II 발현을 필요로 한다.

연구자들은 DP IELs의 분화 과정에서 IECs의 비 전형적 APC의 작용을 탐구하기 위해 C57BL/6 야생 마우스 소장의 다른 부위 중, IECs에서 MHC Ii의 발현을 분석했다. 일련의 유세포분석 실험과 RNA-seq 실험 모두 IECs 작용이 MHC II 항원 제시와 연관됨을 보여주었다. 또한, 연구자들은 DP IELs 분화에 있어서 IECs가 발현하는 MHC II 작용을 알아내기 위해, IECs에서 MHC Ii를 녹아웃한 일종의 특이성 마우스(MHC II△IEC)를 사용했으며, MHC Ilfl/fl 대조군 마우스와 비교를 통해 IELs의 분화에 IECs에서 MHC Ii의 발현이 필요함을 증명했다(그림 1G-H).

 

 

그림 1G-H. 세포분석(G)과 면역형광 실험(H) 모두 MHC IIfl/fl 대조군 마우스에 비해 MHC II△IEC마우스의 DP IELs의 비율이 SP IELs 세포에서 현저하게 떨어짐을 보여줬다. 이밖에 면역형광 실험(H)에 따르면 대부분의 DP IELs가 MHC II를 고발현하는 상피세포의 기저외측면과 접촉하는 것으로 나타났다.

 

2. IECs에서 MHC II의 발현은 IFN-γ의 존재에 의존한다.

IFN-γ이 비조혈 세포(예를 들어 IECs)에서 MHC II의 발현을 강력하게 유도한다는 보도가 있다. 이 결론을 검증하기 위해 연구자들은 IFN-γ 수용체 녹아웃 마우스(IFN-γR−/−)를 사용하였다. IFN-γR−/−마우스의 IECs에서 MHC II의 발현이 검출되지 않았고 DP IELs분화가 심각하게 저해되어 SP T 세포 중 비율이 거의 0에 가까웠으며(그림 2A), 야생 마우스에 anti-IFN-γ 항체를 주입 후, MHC II의 발현수준 및 SP IELs 세포 중 DP 비율이 현저히 낮아지는 등의 실험 결론은 앞서 연구자들의 결론과 일치했다(그림2B). 이외에 IFN-γ는 DP IELs의 분화에 필수적이며 전사인자 T-bet의 발현을 유도하여 DP IELs의 분화를 촉진할 수 있다는 보도가 있었다. 이는 IFN-γ이 DP IELs의 기능 성숙에 중요한 역할을 한다는 것을 보여준다.

 

 

그림 2. IFN-γ이 비조혈 세포(예를 들어 IECs)에서 MHC II의 발현을 강력하게 유도한다.

  

연구자들은 IELs와 IECs에서 DP IELs 분화에 미치는 IFN-γ의 영향을 탐구하기 위해 골수(Bone marrow,BM) 키메라 마우스를 제했다. 즉 공여체 마우스의 다리뼈에서 Bm세포를 취하여 치사선량 조사에 노출된 수용체마우스 체내(공여체 마우스의 조혈세포 → 수용체마우스)에 정맥 주사하고 8주 간의 조혈 재구성기간 후 수용체 마우스를 죽여 얻는다. 그 결과(그림 2C): 조혈 세포(예를 들어 CD4+ IELs)나 비조혈 세포(예를 들어 IECs)를 막론하고 DP IELs의 분화는 전부 완전한 IFN-γR 신호가 필요했다. 또한 기존에 야생 마우스에서 관찰된 소장 부위별 MHC II의 발현량과 DP IELs의 비율의 뚜렷한 차이가 BM 키메라 마우스에서는 모두 관찰되지 않았다. 연구자들은 면역 재구성 후의 수용체 마우스에 호메오스타시스일 때보다 더 많은 IFN-γ이 생성되었고, 이로 인해 장의 미환경을 변화시켜 염증을 초래함으로써 이와 같은 역적 차이를 해소시켰을 가능성이 있다고 추측했 다.

 

그림 2C. DP IELs의 분화는 완전한 IFN-γR 신호를 필요로 한다.

 

연구자들은 MHC II+IECs가 DP IELs 분화에 있어 비 전형적인 APC 작용 여부를 직접 탐구하기 위해 IFN-γR+/+마우스와 IFN-γR−/− 마우스에서 유래한 소장 오가노이드(orgnoids)를 각각 제했다. 그들은 먼저 IFN-γ가 오가노이드에서 체내와 일치한 효과를 발휘한다는 것을 검증했다. IFN-γ는 오가노이드 중 IECs에서 MHC Ii의 발현을 강력하게 유도한다(그림 2D-E). 또한, T-box expressed in T cells(T-bet)이 DP IELs의 분화 과정에서 중요한 상위 조절 인자이며 Runx3의 발현을 유도하고 ThPOK 발현을 억제할 수 있으며 T-bet의 유도로 생성된 세포인자(예를 들어 IFN-γ)는 장 미환경의 자극인자가 존재하는 상황에서 DP IELs의 분화를 가일층 촉진할 수 있다는 연구 결과가 있다. 이에 따라 연구자들은 장의 미환경 자극인자인 TGF-β와 Retinoic acid(RA)가 존재하는 상황에서 IFN-γ와 ovalbumin peptide(OVAp)의 사전 자극 후의 소장 오가노이드 및 anti-CD3ε/CD28 사전 자극 후의 OVA 특이성 CD4+ T세포(OT-II)에 대해 24h 공생배양을 진행하였다(그림 2F). 그 결과, IFN-γ는 MHC Ii의 대량 발현을 유도할 수 있고; MHC II+ IECs은 DP IELs의 분화에 있어 비 전형적인 APC 작용을 하고 또 TGF-β와 RA 자극에 의해 DP IELs의 분화를 더욱 촉진할 수 있었다.

    

그림 2D-E. 유식세포분석(D)과 면역형광 실험(E)에 따르면 IFN-γ 자극 후, IFN-γR+/+마우스에서 유래된 오가노이드 IECs 에서 MHC II의 발현수준이 현저하게 높아졌고 반면, IFN-γR−/− 마우스에서 유래된 오가노이드 IECs 에서의 MHC Ii는 발현되지 않았다.

 

그림 2F-G. 공생배양 실험 설명도(F); IECs에서 MHC Ii의 발현상황(G좌); SP OT-II 세포에서 DP 비율(G우).

  

3. IECs 에서 IFN-γ의 유도에 의해 생성된 PD-L1은 DP IELs의 분화에 중요한 역할을 한다.

상기 실험을 통해 알수 있다시피, MHC II+ IECs는 APC로서 CD4+ IELs에 상동 자극을 할 수 있다. 연구자들은 이들이 기타 MHC Ii와 함께 T세포를 협동 조절할 수 있는 공수용체를 발현할 수 있는 것으로 추측했다. 나아가, 연구자들은 IECs에서 MHC II의 발현이 IFN-γ의 존재에 의존하기 때문에, 이러한 공수용체는 마땅히 IECs의 IFN-γ 신호와 연관이 있을 것이라고 추측했다. 연구자들은 IFN-γ를 통한 처리 혹은 미처리 소장 오가노이드에 대한 RNA-seq 분석 결과, PD-L1 단백질 암호화하는 Cd274 유전자가 MHC II 관련 유전자의 발현과 유의적 상관이 있다는 것을 발견했다(그림 3A-B). 오가노이드 실험(그림 3C)과 체내 실험(그림 3D-E) 모두 IFN-γ가 PD-L1의 발현량에 현저한 영향을 준다는 것을 표명했다. 연구자들은 DP IELs 분화에 IECs에서 PD-L1의 발현이 필요하다는 점을 입증하기 위해 PD-L1 녹아웃 마우스(PD-L1−/−), RAG-1 녹아웃 마우스(RAG-1−/−, 마우스에 성숙한 T, B세포 없음), 특이적으로 IECs에서 PD-L1 타겟 유전자를 녹아웃한 마우스(PD-L1△IEC) 및 Cyagen가 제PD-L1fl/fl 대조군 마우스를 사용하였다. 일련의 실험 결과(그림 F-H) 모두 IECs 에서의 PD-L1이 DP IELs의 분화에 중요한 작용을 하고 있음을 보여주었다.

  

그림 3A-B. 차별적으로 발현되는 유전자의 적외선 열지도(A)와 화산도표(B).

 

그림 3C-E. (C) 농도별로 IFN-γ 처리 후, 소장 오가노이드PD-L1의 발현량; (D) IFN-γR+/+마우스에 비해 IFN-γR−/−마우스 중 PD-L1 발현량이 현저히 낮다; (E) IFN-γR+/+마우스 체내 anti-IFN-γ 항체 주사 후 IECs에서 PD-L1의 발현량이 현저하게 낮다.

  

그림 3F-H. (F) PD-L1+/+ 마우스에 비해 PD-L1−/− 마우스 회장에서의 DP IELs 비율이 현저하게 낮다; (G) 비장 CD4+ T세포를 RAG-1−/− 마우스 체내에 주입 후 마우스 체내에 anti-PD-L1 항체를 추가 시 DP IELs 발육 장애를 초래했다; (H) PD-L1fl/fl 마우스에 비해 PD-L1△IEC 마우스 회장에서의 DP IELs 비율이 현저하게 낮았다.

  

4. 소장 내 MHC II와 PD-L1의 발현 및 DP IELs의 분화에 있어서 미생물군은 아주 중요하다.

소장 내 IFN-γ의 생성과 IECs에서 MHC II의 발현에 모두 미생물군이 필요하다는 보도가 있어 연구자들은 IECs에서 PD-L1의 발현이 미생물군에 의해 조절되는지 그 여부를 탐구하기 위해 무균(Germ-free, GF) 마우스, 무특이 병원체(specific pathogen-free, SPF) 마우스를 사용해 실험을 진행했다. 이러한 실험 결과는 미생물군의 유도에 의해 생성된 IFN-γ가 IECs에서 MHC II와 PD-L1의 발현을 자극할 수 있으며 양자 모두 DP IELs의 분화를 조절할 수 있다는 것을 보여준다.

 

그림 4A. SPF 마우스에 비해, GF 마우스 IECs에서 PD-L1의 발현 수준이 회장에서 현저히 낮아졌고, MHC II 발현량과 DP IELs 비율이 소장 각 부위, 특히 회장에서 현저하게 낮아졌다.

  

그림 4B. 항생제 처리 후 SPF 마우스 IECs에서 PD-L1의 발현 수준이 회장에서 현저히 낮아졌고, MHC II 발현량과 DP IELs 비율이 소장 각 부위, 특히 회장에서 현저하게 낮아졌다.

  

그림 4C. 면역형광 실험에 따르면 SPF 마우스의 회장 내 IECs는 대부분 MHC Ii를 발현했고, 20%가 PD-L1을 발현했으며 GF 마우스에서는 MHC II와 PD-L1의 발현량이 현저하게 낮아졌다.

 

5. PD-1 신호는 ThPOK의 발현을 억제함으로써 DP IELs의 분화를 자극한다.

고전적인 CD4+ T세포와 CD8+ T세포는 각각 T helper–inducing POZ/Krüppel-like factor(ThPOK)와 runt-related transcription factor 3(Runx3)의 발현에 의존하여 자체 계보를 유지한다. 따라서 DP IELS의 분화는 Runx3 발현량의 증가와 ThPOK의 결핍을 필요로 한다. 이밖에, IECs에서 MHC II와 PD-L1의 발현 모두 DP IELs의 분화에 매우 중요하다. 이는 CD4+ IECs의 세포 재프로그래밍에 TCR과 PD-1에서 내보낸 신호가 관여했을 가능성을 나타낸다. 전기 실험 결과, T세포 내생성 PD-1 신호가 DP IELs의 분화에  필수적인 것으로 나타났다(그림 5A-C). 연구자들은 분자 메커니즘을 한층 더 탐구하기 위해 ThPOK-GFP 리포 마우스를 사용했다. 실험 결과, ThPOK의 발현에 대한 PD-1의 억제와 DP IELs의 분화에 PD-1 신호를 필요로 한다(그림 5D-E). 또한 생체외실험 결과(그림 5G-I)에 따르면, PD-1 신호가 고전적인 Src homology 2 domain–containing tyrosine phosphatas (SHP) 통로를 통해 CD4+ IECs 중 ThPOK의 발현을 낮추어주고 나아가 DP IELs의 분화를 촉진한다.

  

그림 5A-C. (A) C57BL/6 야생 마우스에서 상이한 IELA 서브그룹별 PD-1의 발현상황이다. SP IELs가 DP IELs로 분화할 때 Pd-1의 발현량이 낮아진다. (B) PD-L1+/+마우스에 비해, PD-L1−/−마우스 소장에서 DP IELs 비율이 현저히 낮아졌다. (C) PD-L1+/+마우스와 PD-L1−/−마우스에서 유래된 비장 CD4+ T세포를 1:1로 혼합 후, RAG-1−/− 수용체 마우스 체내에 이식한다. PD-L1−/− CD4+ T세포에서 유래된 DP IELs 비율이 현저히 감소하였다.

 

 

그림 5D-F. (D) 실험 안내도: ThPOK-GFP 리포 마우스에서 유래된 비장 T세포를 RAG-1−/− 수용체 마우스 체내에 이하고 재구성 기간 내 수용체 마우스에 대해 anti-PD-1 항체 처리를 진행한다; (E) ThPOK와 Runx3의 발현 수준; (F) DP IELs의 비율.

 

그림 5G-I. (G) CD4+ T세포와 TGF-β, RA, PD-L1을 체외에서 3일 간 공생배양 후 ThPOKhi세포 비율을 측정한다. PD-L1이 ThPOK 발현이 낮아지게 유도했다; (I-H) CD4+T세포와 TGF-β, RA, PD-L1, SHP 억제제(SHPi)를 체외에서 3일 간 공생배양 후, DP IELs의 비율 및 ThPOK와 Runx3의 발현 수준을 측정했다.

 

결론적으로, 이 논문에서 연구자들은 IECs가 장내 DP IELs의 분화를 촉진하는 중요한 조절요소이며 비전형적인 APC 작용을 한다는 것을 발견했다. 장내 미생물군에서 생성된 IFN-γ는 IECs에서 MHC II와 PD-L1의 발현을 자극하여 SP IELs에 TCR 자극과 수용체 신호를 제공함으로써 DP IELs로의 분화를 촉진한다. 또한, 연구자들은 서로 다른 생리적인 위치에 따라 IECs의 유전자  발현프로파일이 달라질 수 있으며, 이 또한 이들 주변의 조직상주형 면역세포(예를 들어 DP IELs의 분화)에도 영향을 준다는 사실도 발견했다.

(註): 논문에서 모든 마우스의 배경은 C57BL/6 유전적 배경이다.

 

인체 장내 미생물 유전체는 인의 두 번째 유전체로 인체 건강과 밀접한 관련이 있다. 많은 연구 결과에 따르면, 장내 미생물은 심혈관, 종양, 면역, 신경, 소화 등을 포함한 다양한 질환의 발병과 밀접한 연관이 있으며 그 인과관계도 점차 밝히고 있다. Cyagen의 올인원 혁신적인 CRO 서비스 네트워크 플랫폼 문헌에 언급된 유전자 편집 마우스, 무균 마우스 모델 및 무균 마우스 기술 서비스를 고객에게 제공하여 동물 모델에 대한 고객의 다양한 수요를 만족시킬 수 있다. 당사의 서비스에 대한 관심이 있거나 문의 사항이 있으면 연락해주기 바란다.

 

Reference: 

 

Moon S , Park Y , Hyeon S , et al. Niche-specific MHC II and PD-L1 regulate CD4+CD8αα+ intraepithelial lymphocyte differentiation[J].

Journal of Experimental Medicine, 2021, 218(4). DOI: 10.1084/jem.20201665

 

 

 

 

  • Contact Us

    영업일 기준 1-2일 내에 답변해 드리겠습니다.

    *

    The username is required

    *

    The user's email is required

    Please enter a valid email address.

    *

    The content is required

    *
  • New Product Launch