녹아웃(KO) 마우스 | Cyagen Korea

 

PD-1과 CTLA-4로 대표되는 면역검사점 억제제, 면역검사점 흥분제, 예를 들어 OX40과 GITR에 대한 관심이 높아지고 있습니다. 2019 년 스웨덴 Alligator Bioscience 는 OX40 인간화 (hOX40) 마우스에서 CTLA-4 와 OX40 을 동시에 겨냥한 단가 이중 특이성항체 ATOR-1015를 테스트한 결과, Journal for ImmunoTherapy of Cancer에 게재됐습니다.[1]

 

 

 

배경

 

 CTLA-4 항체는 단독 투여나 PD-1 항체와의 결합 투여나 좋은 적용 전망을 보이고 있습니다. 예를 들어 미국Bristol Myers Squibbb, BMS가 개발한 Ipilimumab(상품명 Yervoy)의 경우 FDA에서 결직장암,간세포암,악성흉막간피종,흑색종,비소세포폐암,신장세포암의 치료(단독 투약 또는 Nivolumab과 합동 투약)로 승인받았습니다{2}. 하지만 CTLA-4 항체 면역관련 불량사건 (immune-relatedadverse events, irAEs) 은 위장독성, 피부독성, 간독성 등 골치 아픈 문제였습니다. 이 문제는 두 종류의 항혈소판 결합을 사용하여 해결할 희망이 있습니다. 이전에 우리는 AstraZeneca 가 개발한 PD-1/CTLA-4 쌍항(이중항혈소판) MEDI5752 에 대해 얘기했는데,이번에는 Alligator Bioscience 의 CTLA-4/OX40 쌍항 ATOR-1015 가 어떻게 표현하는지 살펴보겠습니다.

 

 

ATOR-1015의 구성

 

CTLA-4와 OX-40은 모두 T세포, 특히 종양의 미세환경 속 Treg세포에서 높게 표현됩니다.따라서 단항 (단일클론항체) 보다는 이 두 가지 면역검사점을 동시에 표적으로 하는 쌍항(이중항혈소판) 이론상 종양구역을 더 정확하게 위치시킬 수 있으며, 이는 T세포의 체계적인 활성화를 저하시키고 치료효과를 높일 수 있습니다. 또한 CTLA-4 억제형 항체와 OX40 흥분형 항체를 연동하여 T세포의 증가와 효과 기능을 현저히 향상시키는 강력한 항종양 작용이 있다는 연구결과가 이미 나와 있습니다[3]. ATOR-1015는 동시 표적 CTLA-4와 OX40의 IgG1 쌍항(이중항혈소판)입니다. 그 OX40 결합 부분은 ALLIGATOR-GOLD® 인간 scFv 문고에서 분류나왔습니다. 그 CTLA-4 결합부는 안정성과 친화성을 높인 사람 CD86의 Ig모델 V자형 도메인(domain)입니다(그림1A).

 

 

ATOR-1015는 과녁 단백질과 결합하여 그 결합체와의 결합을 차단할 수 있습니다.

 

ATOR-1015와 과녁단백질을 표현하는 CHO세포의 결합 및 ELISA 실험 등을 통해 연구자들은 ATOR-1015가 높은 친화력으로 CTLA-4와 결합하여 CD80 및 CD86과의 상호작용을 차단한다는 사실을 밝혀냈습니다(그림1B-C);또 OX40의 도메인(domain) 2와 결합해 OX40L와의 상호작용을 억제합니다(그림1D-E).

 

 

그림 1. ATOR-1015는 CTLA-4 및 OX40과 결합하여 천연배체와의 결합을 차단합니다[1]

 

ATOR-1015는 CTLA-4를 표현하는 세포와 OX40을 표현하는 세포를 교대할 수 있습니다

 

연구자들은 각각 PKH26 과 PKH67 쌍을 사용하여 CTLA-4 를 표현하는 HEK 세포와 OX40 을 표현합니다. CHO 세포를 염색하여 골고루 섞은 후 ATOR-1015, αCTLA-4 항체, αOX40 항체 또는 IgG1 대조 항체 공동 배양합니다.그 결과 ATOR-1015 로 처리된 샘플에서만 복용량 의존성이 증가한 PKH26 과 PKH67 쌍양성 세포 복합물 (그림 2A) 이 있는 것으로 나타났습니다. 이는 ATOR-1015 가 CTLA-4 를 표현하는 세포를 OX40 을 표현하는 세포와 교차시킬 수 있음을 보여줍니다.

 

 

ATOR-1015 는 T세포를 활성화시킵니다

 

T세포에 대한 ATOR-1015의 활성화 작용을 탐구하기 위해 연구자들은 형광소 효소 보고 유전자 실험을 고안했습니다. 그들은 CTLA-4 와 형광소 효소를 표현하는 Jurkat 세포를 만들었는데, 그 형광소 효소 보고 유전자는 IL-2 프로모터에 의해 조절됩니다.IL-2 시동자는 TCR/CD28 활성화 신호에 응답하며, 다른 하나는 CD80/CD86과 TCR 활성화가 가능한 인공 T세포 활성화제를 표현하는 Raji 세포다.이 두 가지 세포가 공생할 때 CD80/CD86은 CTLA-4와 비교하여 CD28보다 높은 친화력으로 결합하여 T세포의 활성화를 차단하여 IL-2가 생기지 않고 형광신호가 없습니다.ATOR-1015 를 추가하면 ATOR-1015 는 CTLA-4 와 결합되어 리간드와의 결합을 차단했습니다. 따라서 CD80/CD86은 CD28과 결합하여 T세포를 활성화시켜 IL-2를 발생시키고 형광소 효소표현을 하여 형광신호를 발생시킵니다(그림2B).이 밖에 연구자들은 ATOR-1015가 인간 원대의 T세포를 활성화시키는 역할을 하는지에 대해서도 탐구했습니다.실험 결과에 따르면 CTLA-4 (그림 2C-D) 또는 FcγRI (그림 2E) 와 교차할 때 ATOR-1015 는 OX40 을 통해 T 세포 활성화를 유도할 수 있습니다.

 

 

 

그림 2. ATOR-1015는 세포 집합을 유도하여 T세포를 활성화시킵니다[1]

 

ATOR-1015는 Tregs의 제거를 유도할 수 있습니다

 

연구자들은 ADCC 보고 유전자 실험을 통해 ATOR-1015 가 ADCC 를 유도하는 능력을 간접적으로 측정했습니다.그 결과 CTLA-4와 OX40을 표현하는 CHO세포에서 αCTLA-4와 αOX40의 단항연합급약 또는 별도급약보다 ATOR-1015를 넣으면 FcγRIIIa의 표현이 현저히 활성화되는 것으로 나타났습니다(그림3A-B).또한 유동식 실험에서는 CTLA-4와 OX40 표현의 상향조정이 인간원대 Tregs의 활성화로 나타나며, 이 중 후자의 상향조정이 두드러지는 것으로 나타났습니다(그림3C-D).

 

활성화 Tregs 와 FcγRIIIa 를 함께 배양할 때 ATOR-1015 를 추가하면 FcγRIIIa 표현의 현저한 증가를 검사할 수 있습니다 (그림 3E).활성화 Tregs를 원대의 NK세포와 함께 배양할 때 ATOR-1015 와 αCTLA-4 및 αOX40 단일 항련이 Tregs 에 대한 복용량 의존성 분해를 관찰할 수 있습니다 (그림 3F).

 

 

 

그림 3. ATOR-1015는 FcγR신호를 유도하여 표적단백질을 나타내는 세포를 지웁니다[1]

 

ATOR-1015 는 항종양 반응과 장기 면역 기억을 유도합니다

 

ATOR-1015 의 CTLA-4 결합 도메인과 마우스의 CTLA-4 결합 도메인 (mCTLA-4) 은 강한 교차 반응이 있지만 OX40 결합 도메인과 mOX40 은 교차 반응이 없기 때문에 연구자들은 프랑스 genOway 에서 도입한 hOX40 마우스를 사용했습니다. Cyagen 바이오, genOway와 전략적 제휴를 맺고 이 마우스를 들여왔습니다. ( Cyagen 바이오, genOway와 전략적 제휴를 맺고 이 마우스를 들여왔습니다.) 이 마우스의 OX40 단백질 세포 외 도메인 서열은 성인 소스 서열로 대체되어, 마우스의 막 횡단 도메인과 세포 내 도메인 서열을 보존하고, 마우스 내원성 프로모터에 의해 구동됩니다. 연구자들은 이 마우스에 MB49 마우스의 방광암세포를 이식해 동원종양 모형(syngeneic tumor models)을 만들었습니다. 체내 실험 결과 ATOR-1015는 종양의 성장을 현저히 억제하고 hOX40  마우스의 생존율을 높이며(그림4A-D) 최소 5개월 이상의 종양특이성을 유도하는 장기면역기억을 가지고 있습니다(그림4E-F).

 

 

그림 4. ATOR-1015 항종양 반응과 면역기억을 유도합니다[1]

 

ATOR-1015 는 종양에 위치를 측정할 수 있으며 종양에서 CD8+ T/Treg 세포의 비율을 높입니다

 

항 종양 효과는 또한 hOX40 마우스의 MC38 상 동성 종양 모델에서도 검증되었습니다. 체내 실험 결과, ATOR-1015 는 종양 성장을 크게 억제하고  마우스의 생존율을 높입니다 (그림 5A-C). 항체 (hIgG+세포가 total live CD45+세포의 백분율로 표시됨) 와 결합된 세포의 비율을 감지했습니다.결과에 따르면 용제와 IgG1대조조과 α CTLA-4에 비해  ATOR-1015 와 αOX40단항은 선택적으로 종양 침윤성 T 세포를 결합합니다 (그림 5D-E).

 

 

 

그림 5. ATOR-1015는 종양에 위치위치를 측정할 수 있으며 항종양반응을 유도합니다[1]

 

ATOR-1015의 종양 위치추적 능력을 더 연구하기 위해 연구자들은 Tregs와 CD8+T 세포의 수와 활성화 상태를 조사했습니다.그 결과, hOX40 마우스의 MC38 동원종양 모델에서 ATOR-101 처리 24 는 단항 단독 투여에 비해 종양에서 CD8+ T/Treg 세포의 비율을 크게 높였습니다.그러나 비장에는 이 현상이 없습니다  (그림 6A-B).이 비율이 높아진 것은 종양 중 Tregs 비율이 떨어졌기 때문(그림6C)과 CD8+T세포 비율 상승(그림6D)입니다. 또한 ATOR-101 처리 후 CD8+T 세포에서 CD107a 와 입자효소 B 의 표현이 현저히 증가하여 세포 독성 표형을 가지고 있음을 알 수 있습니다 (그림 6E-F).

 

 

 

 

 

그림 6. ATOR-1015는 종양의 Tregs를 지우하고를 활성화시킵니다 Teffs[1]

 

 

ATOR-1015 는 αPD-1항체 치료 효과를 향상시킵니다

 

연구자들은 ATOR-1015의 αPD-1항체 치료 효과에 대한 증강작용을 탐구하기 위해 다시 동원종양 모델을 사용했습니다.실험 결과, 종양 (MB49) 잡합자 hOX40 마우스에서  ATOR-1015 또는 αPD-1 단항단독투약을 사용하면 강한 항종양 반응을 유도할 수 있는 것으로 나타났습니다. 이 두 가지를 합친 약은 모든 종양 보유 마우스들 사이에서 완전히 완화되는 것을 관찰할 수 있습니다 (그림 7).

 

 

 

 

 

그림 7. ATOR-1015 αPD-1항체의 치료효과를 증대시킵니다[1]

 

 

결론

 

hOX40 마우스에 기반하여 구축된 동원종양 모델에서 CTLA-4와 OX40을 동시에 겨냥하여 AOR-1015는 종양부위에 효율적으로 위치하여 면역억제성 Treg의 비율을 낮추고 CD8+T세포의 숫자를 높여 세포독성효과를 활성화시킴으로써 항종양작용을 합니다.현재 ATOR-1015는 말기 및 혹은 난치성 실물 악성종양 환자에 대한 임상 1기 첫 인체시험(NCT03782467)을 마쳤습니다.하지만, I기 시험 데이터는 ATOR-1015의 수액 관련 불량반응이 있는 것으로 밝혀졌으며, 이는 항체(anti-drug antibodies)의 발생과 관련이 있을 수 있으므로 임상 데이터의 철저한 평가가 필요합니다[4].

 

OX40인간화는 마우스 종양 연구에 도움

 

 Cyagen 바이오는 genOway와 전략적 파트너십을 맺고 이 hOX40  마우스의 업그레이드 버전을 도입했으며, 보다 생리적인(높은) 수준의 hOX40 표현을 가지고 있어 임상 관련성과 전환성을 크게 높였습니다.

 

품계배경:C57BL/6N

 

품계 구성 정책:

 

 마우스 OX40 유전자 지점에 전장인간화 OX40 서열을 knock in하여 구축하였으며, 이 모델은 OX40 단백질을 전인간화 표현한 것으로, 인간화 엑토도메인(ectodomain), 막관통영역(transmembrane domain), 세포내 도메인(Intracellular domain)을 포함하고 있습니다.

 

품계 설명:

 

☑hOX40은  마우스의 몸에서 정상적인 생리 표현과 조절 패턴을 가지고 있습니다.

☑표적점과 배체의 상호작용이 유지됐습니다.

☑마우스 표적 유전자를 표현하지 않아 교차반응을 피합니다.

☑마우스 의 면역체계 기능은 건전합니다.

 

연구 응용:

 

이 모델은 면역건전한 생쥐 체내에서 hOX40 표적약물의 유효성 및 안전성을 평가하는 데 사용됩니다.

 

모델 인증:

 

1. OX40 표현 검사

 

 

 

그림 1. hOX40 마우스에서 hOX40 마우스의 표현 패턴은 야생 마우스의 표현 패턴과 일치합니다

 

mIL-2 가 존재할 때, 항체 αCD3/αCD28 로 비장 세포를 활성화시켜 hOX40 과 mOX4 가 hOX40 마우스와 야생형 마우스에서 어떻게 표현되는지 검사합니다.(A)Tregs(viable,CD3+CD4+CD25+Foxp3+);(B)전통 CD4+T세포(viable, CD3+CD4+Foxp3+)(C) CD8+T세포 (CD3+CD8+);그리고 hOX40과 mOX40은 hOX40 마우스와 야생 마우스에서 표현하는 동력학: (D)Treg, (E)전통 CD4+T세포와 (F)CD8+T세포입니다.

 

 

2. OX40 기능 검사

 

그림 2. hOX40은 Teff에 효능이 있습니다

 

비장과 림프절이 분리된 T세포(CD8+)는 αCD3/αCD28항체와 hOX40L 또는 IgG-Fc 처리를 통해 hOX40L 처리가 hOX40  마우스의 체내 T세포(CD8+) 증식과 IFN-γ 분비를 촉진하는 것으로 나타났습니다.(A) 스트림 그래프 (B) 대표 직방도 (C) ELISA 검사에서 상청액 중 mIFN-γ 발생을 배양합니다.

 

3. 체내 약효 실험

 

 

그림3.  αhOX40항체는 hOX40 마우스에서 항종양 활성이 있습니다

 

 MC38 종양을 이식한 hOX40  마우스를 αhOX40항체 (BMS-986178 유사물)로 처리합니다. 종양의 증식은 분명히 억제되었습니다.

 

 

참고 문헌:

 

[1] Kvarnhammar AM, Veitonmäki N, Hägerbrand K, et al. The CTLA-4 x OX40 bispecific αbody ATOR-1015 induces α-tumor effects through tumor-directed immune activation. J Immunother Cancer. 2019 Apr 11;7(1):103. doi: 10.1186/s40425-019-0570-8. PMID: 30975201; PMCID: PMC6458634.

[2] https://www.cancer.gov/about-cancer/treatment/drugs/ipilimumab

[3] Redmond, W. L., Linch, S. N., & Kasiewicz, M. J. (2014). Combined targeting of costimulatory (OX40) and coinhibitory (CTLA-4) pathways elicits potent effector T cells capable of driving robust αtumor immunity. Cancer immunology research, 2(2), 142–153. https://doi.org/10.1158/2326-6066.CIR-13-0031-T

[4] https://alligatorbioscience.se/en/research-and-development/pipeline/ator-1015/

 

 

 

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